一种快速检测β-胡萝卜素的方法

β-胡萝卜素是类胡萝卜素之一，是橘黄色脂溶性化合物，它是自然界中最普遍存在也是最稳定的天然色素。β-胡萝卜素分子式为 C₄₀H₅₆，紫红或暗红色的结晶性粉末。不溶于水，微溶于乙醇和乙醚，易溶于氯仿苯和油。熔点176～180℃。β-胡萝卜素是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。β-胡萝卜素比较稳定，效力也强，β-胡萝卜素的分子结构相当于2个分子的维生素A，进入机体后，在肝脏及小肠粘膜内经过酶的作用，其中50%变成维生素A，有补肝明目的作用，可治疗夜盲症。目前常用于测定β-胡萝卜素的方法主要有紫外分光光度法和高效液相色谱法。本文主要是基于国标GB/T5009.83的液相方法的基础上，优化前处理，使方法能简便，准确，快速的测定保健品中β-胡萝卜素。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；石油醚（分析纯，沸程30℃～60℃）；三氯甲烷（分析纯）；β-胡萝卜素对照品（来源：Dr；批号：20402；含量：96.3%）；多种维生素片（女士）。
超声波清洗器（EQ-500）；高效液相色谱仪（安捷伦1260）；色谱柱：岛津Inertsil C18，4.0mm*75mm，3μm。
1.2 色谱条件
流动相：甲醇:乙腈=90:10。流速：1.0ml/min；柱温：40°C；进样量：10μl。
1.3 对照品溶液的配制
1.3.1 对照品贮备液的配制：
精确称取β-胡萝卜素对照品10.32mg于100ml容量瓶中，用约50ml三氯甲烷溶解后，再用石油醚（沸程30℃～60℃）定容至刻度，超声2分钟，使β-胡萝卜完全溶解，放冷至室温，摇匀，放在-18℃的冰箱中储存备用。
1.3.2对照品溶液的配制：
对照品溶液的制备：精密吸取β-胡萝卜素贮备溶液5.00ml于50ml容量瓶中，加入甲醇：乙腈=（7:3）混合液至刻度，摇匀，即得β-胡萝卜素对照溶液。
1.3.3标准工作曲线绘制：
分别精密吸取β-胡萝卜素对照品溶液1ml、2ml、5ml、10ml、15ml于50ml容量瓶中，加甲醇：乙腈=（7:3）混合液至刻度，摇匀，即得β-胡萝卜素标准使用液，分别得到浓度为0.1987632μg/ml、0.3975264μg/ml、0.993816μg/ml、1.987632μg/ml、2.981448μg/ml的工作标准溶液,经0.45μm的微孔滤膜过滤，进样量为10μl,以浓度C（μg/ml）为横坐标、峰面积(A)为纵坐标，绘制标准工作曲线。
1.4 供试品溶液的制备
精密称取0.2g研磨均匀细腻的样品，置于50ml棕色容量瓶中，加入约三分之二的甲醇：乙腈=（7:3）混合液，混匀，35度超声20min，定容，取上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
1.5 线性实验
将标准品贮备液分别吸取5个适量的体积，加加甲醇：乙腈=（7:3）混合液配成0.1987632μg/ml、0.3975264μg/ml、0.993816μg/ml、1.987632μg/ml、2.981448μg/ml 5个浓度，经0.45μm的微孔滤膜过滤，每个浓度以10μl注入色谱系统。
1.6 精密度实验
称取6份样品，按1.4试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD（%）。
1.7 加标回收率实验
加标样品的处理：精密称取0.2g研磨均匀的样品9份，于50ml容量瓶中，分成3组，每组3份，于每一组中分别精密加入浓度为9.93816μg/mlβ-胡萝卜素标准工作液1.6ml、2.0ml、2.4 ml。加入约三分之二的甲醇：乙腈=（7:3）混合液，混匀，35度超声20min，定容，取上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤，作为加标溶液；取该加标溶液10μl进样。
1.8稳定性试验
试验方法：取β-胡萝卜素样品溶液（浓度为0.993816μg/ml）分别在室温下放置0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时取进样，进样量为10μl，计算其峰面积的相对标准偏差RSD（%），考察该方法的稳定性。
2 结果与讨论
2.1 色谱行为
（1）色谱柱 β-胡萝卜素是类胡萝卜素的一种，有时候会受同类物质的影响，很难分离，而本文采用了岛津Inertsil C18，4.0mm*75mm, 3μm色谱柱，能达到分离的要求，同时检测时间也比较快。
（2）检测波长 实验证明在448nm的波长处，绝大多数的杂质没有紫外吸收，而β-胡萝卜素灵敏度却较高，所以波长448nm出的峰形很好，见图1：

图1样品色谱图

（3）溶剂的选择 实验证明采用甲醇：乙腈=（7:3）混合液对样品提取，回收率在98.31%-101.45%，能很好的提取样品中β-胡萝卜素，而且处理方法简单，耗时短。

2.2线性实验结果，见表2。

表2 线性实验结果

以标准品的5个梯度浓度与其峰面积进行线性回归，拟合线性方程为y=147.35315x+0.584801，R²=0.99981，在浓度为0.1987632μg/ml至2.981448μg/ml之间呈现良好的线性。
2.3检出限和定量限试验：
分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比（S/N）计算。DL定义为S/N=3时对应的待分析物浓度，QL定义为S/N=10时对应的分析物浓度。
2.3.1 检出限
精密量取浓度为9.93816μg/ml的β-胡萝卜素工作标准溶液1ml至250ml容量瓶中, 加甲醇：乙腈=（7:3）混合液至定容，即得浓度为0.03975264µg/ml的标准品溶液。
取信噪比为（3：1）定方法的检测浓度为：DL（β-胡萝卜素）＝0.03975264µg/ml，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.03975264µg/ml×50ml/0.2g=9.93816µg/g。

2.3.2 定量限

取信噪比为（10∶1）定方法的检测浓度为：DL（β-胡萝卜素）＝0.131183712µg/ml，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.131183712µg/ml×50ml/0.2g =32.795928µg/g。
2.4精密度结果，见表3。

表3 精密度的实验结果

6份样品含量的RSD（%）为：0.7%，表明该方法有良好的精密度。
2.5稳定性试验的结果，见表4。

表4 稳定性试验的结果

结论：β-胡萝卜素溶液分别在室温下放置0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时，其峰面积的RSD（%）为：2.0%，表明β-胡萝卜素溶液在室温下24小时内的稳定性较好。
2.6加标回收率实验，见表5。

表5 加标回收率实验结果

从表5中可以看出多种维生素片（女士）中平均回收率为：99.4%，相对标准偏差（RSD）为0.4%。
3 结论
本文采用甲醇:乙腈=90:10作流动相，经岛津Inertsil C18，4.0mm*75mm, 3μm色谱柱，使用高效液相色谱法，能很快把多种维生素片（女士）中β-胡萝卜素分离，进行检测。通过测定线性关系，检出限，定量限，精密度，稳定性和回收率，表明该方法用于测定β-胡萝卜素的含量，结果令人满意。