鼢鼠(Eospalax)线粒体基因组测定及注释分析
西安国联质量检测技术股份有限公司
安平中心：李瑞
摘要【目的】获得鼢鼠线粒体基因组全序列，为线粒体基因组功能标记及进化生物学等研究提供基础资料。【方法】参考鼹型鼠等动物的线粒体基因组序列，设计出可覆盖鼢鼠线粒体基因组的16对引物，采用PCR产物直接测序法测得甘肃鼢鼠线粒体基因组全序列，分析其基因组的特点和基因结构。并结合GenBank中发表的啮齿类动物基因组全序列，探讨啮齿类动物的系统进化关系。【结果】鼢鼠线粒体基因组全长16354bp，其中包括22个tRNA基因、13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因和2个D-loop区。碱基组成为33.5%A、24.2 %C、12.3 %G、30.0 %T。【结论】鼢鼠线粒体基因组结构及其信息和其他啮齿类动物的结构一致，线粒体变异保守。研究结果为鼢鼠的低氧适应、系统发育关系等提供了基础资料。
关键词 鼢鼠；线粒体基因组；序列分析
鼢鼠(Eospalax)是分布于我国的主要啮齿类动物之一，其体型较小，栖息于洞穴内有挖掘活动，扩散能力强，数量波动大，是生态系统中重要的初级消费者，处于生态系统中的中心位置，草原生态系统中其能流比重很大。
动物线粒体(Mitochondrion)基因组为双链闭合环状分子，少数也有线性的，它们具有分子量相对较小、结构简单、缺少重组、母性遗传和进化速率快等特点，已成为动物系统发育与进化、群体遗传学、分子生态学以及疾病机理研究等领域的理想材料。甘肃鼢鼠是仅分布于我国西北部的土著物种，其外形似中华鼢鼠，主要分布于甘肃临潭县及其附近地区。目前对线粒体DNA的研究主要在动物分子遗传学、分子生态学、种群遗传结构分析、遗传多样性、物种和品系鉴定、保护遗传学等方面得到了广泛应用[4，5]
1. 实验材料和方法
1.1 实验材料
鼢鼠：采集于天祝（经度102.84、纬度 37.2）1个群体；鼢鼠解剖采集肝脏及肌肉组织样品，-20℃保存备用。
1.2 线粒体DNA的提取
用剪刀将肝脏及肌肉材料剪成小块，取0.1cm左右的小块肝脏及肌肉材料，采用常规的SDS/蛋白酶K裂解，酚氯仿提取DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
1.3 引物设计和PCR扩增
通过Clustal X1.83比对，寻找相对应保守区域位置，用Primer Premier5.0引物设计软件设计引物，并对每条引物进行评价和修改，最终确定16对引物。以所提取的DNA为模板，用16对引物扩增覆盖整个线粒体基因组。
利用引物进行PCR扩增，反应体系总体积为50μL，其中含有6μL PCR buffer、3μL MgCl2（1.5mmol）、MgCl2，2μL dNTPs （100μL mol）、上下游引物各2μL （0.25μL mol）、Taq DNA聚合酶2μL （1U）、总DNA约为2μL （25ng）、去离子水31μL。反应程序为：94℃预变性4 min，94℃变性50s，48-45℃退1min，72℃延伸1 min 30s，循环30次，之后72℃延伸10min，并根据不同引物的退火温度和扩增反应的实际效果进行优化。
取 5 μL PCR扩增产物，和2 μL DNA marker 2000，进行1.0％琼脂糖凝胶（1×TBE）5V/电泳，用紫外观察PCR产物扩增情况，凝胶成像仪扫描记录结果。
1.4 纯化、测序和序列拼接
在PCR产物中加入5 U SAP和2 U ExoⅠ，震荡混匀，37℃保温1 h，然后75℃保温15 min以灭活SAP和ExoⅠ酶，纯化好的模板可以在4℃保存24 h或-20℃长期保存。将纯化后的引物送往上海生工生物技术服务有限公司用ABI-3730序列自动分析仪进行双向测序。利用DNASTAR和测序峰图结果分析软件Chromas 2.22校对测序图，DNAMAN拼接序列。得到甘肃鼢鼠线粒体全基因组全序列。
2. 结果
2.1 鼢鼠线粒体基因组基因定位
2.2.1 鼢鼠线粒体2个rRNA的分析
哺乳动物线粒体的rRNA具有高度的保守性，它们的位置固定，12S rRNA位于tRNA-phe 和tRNA-Val之间，16S rRNA位于tRNA-Val和 tRNA-Leu之间，12S rRNA起始位置为68，终止位置为1019，长度为952bp，16S rRNA起始位置为1086，终止位置为2651，长度为1566。同时我们比对了鼢鼠和中华鼢鼠的rRNA基因和蛋白质基因，12S rRNA和16S rRNA的相似性分别为91.0%和87.3%，高于蛋白质编码基因之间的相似性。
2.2.3 鼢鼠线粒体基因组结构
除NADH脱氢酶亚基6外均在H链上，虽然鼢鼠染色体数目少、染色体大，但与其它哺乳动物线粒体全基因组相比，它的线粒体基因组的结构与其它哺乳动物是十分相似的。甘肃鼢鼠线粒体基因组结构见图1。
注：ND: NADH脱氢酶亚基（NADH dehydrogenase subunit）、Cox：细胞色素氧化酶亚基(cytochrome oxidase subunit)、Atp：ATP合成酶亚基(ATP synthase F0 subunit)、Cyt b：1个细胞色素b编码基因(cytochrome b)。
图1 甘肃鼢鼠线粒体基因组结构简图
Fig.1 The gene organization of Eospalax cansus mitochondrial genome
3. 讨论
甘肃鼢鼠线粒体基因组的D-loop区，长度为933bp，比中国地鼠D-loop区（867bp）长。D-loop区对目的基因是不可缺少的，虽然D-loop区不能编码蛋白质但对于遗传信息表达是不可缺少的，在它上面有调控遗传信息表达的核苷酸序列，具有遗传效应的，比如RNA聚合酶结合位点是具有遗传效应的。8只甘肃鼢鼠中有5个单倍型：3只临潭群体共享1个单倍型，2只天祝群体独享单倍型；其余个体均独享单倍型，表明了甘肃鼢鼠线粒体DNA D-loop区碱基变异快、进化快的特性，符合啮齿动物线粒体变异大的现象。
随着研究的深入，以线粒体DNA中完整的基因序列或多个基因序列协同而获得遗传信息来探讨物种的系统进化关系，将是以后研究发展的主要方向。目前，线粒体DNA已经在许多哺乳类动物的起源进化的研究中取的了重大进展，而对甘肃鼢鼠的起源进化的研究却很少，并且存在着甘肃鼢鼠属于瞎鼠科和仓鼠二者之争，因此，为了更好的阐明甘肃鼢鼠的起源，还需要做更多、更深入的研究。
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