液质联用仪（LC-MS）基础知识（2018官方整理资源）

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2018/10/12

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液质联用（LCMS）

液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）是将液相色谱仪与质谱仪联用的仪器，用于样品定性定量分析。其特点是将应用范围极广的液相色谱分离方法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来的一种现代分析技术。其工作原理为：样品通过液相色谱分离后的各个组分依次进入质谱检测器，各组分在离子源被电离，产生带有一定电荷、质量数不同的离子。不同离子在电磁场中的运动行为不同，采用质量分析器按不同质荷比（m/z）把离子分开，得到依质荷比顺序排列的质谱图。通过对质谱图的分析处理，可以得到样品的定性和定量结果。
液质联用仪基本结构
LC-MS主要包括液相色谱系统、接口、离子源、质量分析器、检测器、真空系统、电气系统和数据处理等。
一、液相色谱
液相色谱部分和普通LC基本相同，由进样系统、输液系统、分离系统、检测系统等组成，而在LC-MS系统中，MS部分作为LC的检测器。
进样系统：早期使用隔膜和停流进们器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。
输液系统：主要包括贮液器——用于贮存流动相；输液泵——高压泵的输出压力一般在150～500 kg／cm²。(1 kg／cm²=98．0665 kPa)，流速在0.01～10 mL／min，对高压泵的要求是流速恒定，无脉动，流量可以调节；过滤器——用于过滤微小杂质；脱气装置——若流动相中所含的空气不除去，则流动相通过色谱柱时其中的气泡受到压力而压缩，流出色谱柱后到检测器时因常压而将气泡释放出来，造成检测器噪声增大，使基线不稳，仪器不能正常工作；梯度洗脱装置——有两种方式：一种称低压梯度，指常压下溶剂按一定比例混合后再由高压泵输入色谱柱，又称外梯度；另一种称高压梯度，指先用高压泵将各溶剂输入混合器混合，再送入色谱柱，也称为内梯度。
分离系统：包括色谱柱、连接管和恒温器等。与LC相比，LC-MS一般流速较低（高流速可能影响雾化效果），所以一般用窄径柱，即2mm或2.1mm的，粒径一般为3.5μm，也有5μm的。如果用内径4.6mm的，流速就和普通做液相一样，但是可以柱后分流，这样进入质谱的量也不会太大。
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二、接口与离子源
LC-MS的接口技术难度大于GC-MS，这是因为液相色谱中的流动相是液体，而质谱检测的是气体离子，所以接口技术必须要解决液体离子化的难题。液质联用中最常用的电离源有大气压电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI），两者同属于大气压电离（API）技术，其离子化过程发生在大气压下。
ESI: 其工作原理是将液滴变成蒸汽，产生离子发射的过程中形成的溶剂由液相泵输送到ESI Probe，经其内的不锈钢毛细管流出，这时给毛细管加2－4kv的高压，由于高压和雾化气的作用，流动相从毛细管顶端流出时，会形成扇状喷雾，使液滴生成含样品和溶剂离子的气溶胶。电喷雾离子化可分为三个过程：1）形成带电小液滴：由于毛细管被加高压，造成氧化还原反应，形成带电液滴。2）溶剂蒸发和小液滴碎裂：溶剂蒸发，离子向液滴表面移动，液滴表面的离子密度越来越大，当达到Rayleigh (瑞利）极限时，即液滴表面电荷产生的库仑排斥力于液滴表面的张力大致相等时，液滴会非均匀破裂，分裂成更小的液滴，在质量和电荷重新分配后，更小的液滴进入稳定态，然后再重复蒸发、电荷过剩和液滴分裂这一系列过程。3）形成气相离子：对于半径<10nm的液滴, 液滴表面形成的电场足够强，电荷的排斥作用最终导致部分离子从液滴表面蒸发出来，而不是液滴的分裂，最终样品以单电荷或多电荷离子的形式从溶液中转移至气相，形成了气相离子。ESI属于最软的电离方式，通常只产生分子离子峰。适合热不稳定的极性分子，能分析小分子及大分子。
APCI:APCI的离子化作用可以有三种理论阐述：1）经典APCI：由电晕放电针产生的电子轰击空气中的主要成分N₂、O₂、H₂O以及溶剂分子得到初级离子N₂⁺、O₂^-、H₂O⁺和CH₃OH₂⁺等。再由这些初级离子与被分析物分子进行电子或质子交换产生出被分析物的分子离子。2）离子蒸发：此机制与ESI过程相似，存在于APCI分析中的强极性分子和可在溶液中预先形成的离子及离子化合物。3）摩擦电APCI：当流动相和分析物进入喷口时会被喷雾气体“撕裂”成为液滴，“撕裂”过程中气体和液体界面上的“摩擦”作用产生电荷并使得分析物分子离子化。相对于ESI而言，APCI的离子化方式使某些化合物碎片显著增加，其中最明显的就是脱水碎片的增加。
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各品牌离子源图设计结构
三、质量分析器

质量分析器是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分，离子通过质量分析器后，按不同质荷比（m/z）分开，将相同m/z的离子聚焦在一起，组成质谱。常见的质量分析器有五种。
1、单聚焦质量分析器
单聚焦质量分析器其主要部件为一个一定半径的圆形管道，在其垂直方向上装有扇形磁铁，产生均匀、稳定磁场，从离子源射入的离子束在磁场作用下，由直线运动变成弧形运动。不同m/z的离子，运动曲线半径R不同，被质量分析器分开。单聚焦质量分析器结构简单，操作方便，但分辨率低。
2、双聚焦质量分析器
为了提高单聚焦质量分析器的分辨率，通常采用在磁分析器之前加一个扇形电场，构成双聚焦质量分析器。扇形电场的作用是将质量相同但速度不同的离子分离聚焦，即具有速度分离聚焦的的作用。经过聚焦后的不同离子束再按质荷比依次进入检测器，实现速度和方向双聚焦的功能。
3、四极杆滤质器
四极杆内所包围的空间存在双曲线形电场。从离子源入射的加速离子穿过四极杆中的电场会受到电场作用，只有选定的m/z离子以限定的频率稳定的通过四极杆滤质器，其他离子则碰到极杆上被吸滤掉，不能通过，即达到“滤质”的作用。四极杆滤质器结构紧凑，体积小，扫描速度快，适用于LC-MS联用仪。
4、离子阱
由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。离子阱可以存储离子，待离子累积到一定数目后，升高环电极上的射频电压，离子按质量从高到低依次离开离子阱，被电子倍增监测器检测。
5、飞行时间质量分析器
飞行时间质量分析器既不用电场也不用磁场，其核心是一个离子漂移管。离子在其中的飞行时间与离子的质荷比的平方根成正比。对于能量相同的离子，质荷比越大，达到检测器所需的时间越长。根据这一原则，可以把不同质荷比的离子依据其飞行速度不同而分离。漂移管越长，分辨率越高。飞行时间质量分析器具有较大的质量分析范围和较高的质量分辨率，尤其适合蛋白等生物大分子分析。
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四、检测器

用于接收离子束的装置。主要有电子倍增器、光电倍增器、微通道板等。
五、真空系统
质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。质谱仪真空系统一般由机械真空泵（前极低真空泵），扩散泵或分子泵（高真空泵）组成。
质谱分析常见术语
质荷比(mass charge ratio):离子的质量( 以相对原子量单位计) 与它所带电荷(以电子电量为单位计以)的比值, 叫作质荷比，简写为m/z。
质荷比是质谱图的横坐标,是质谱定性分析的基础。
离子丰度 (Abundance of ions):检测器检测到的离子信号强度。
离子相对丰度 (Relative abundance of ions):以质谱图中指定质荷比范围内最强峰为100 ％, 其它离子峰对其归一化所得的强度。标准质谱图均以离子相对丰度值为纵坐标。谱峰的离子丰度与物质的含量相关,因此是质谱定量的基础。
基峰(Base peak)：在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰叫作基峰。基峰的相对丰度为100 ％
本底(Back ground)：在与分析样品的相同条件下，不送入样品时所检测到的质谱信号，包括化学噪声和电噪声。
总离子流图(Total ions current,TIC)：在选定的质量范围内, 所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图。色质联用时, TIC 即色谱图。
质量色谱图(Mass chromatograph)：指定某一质荷比的离子强度对时间或扫描号所作的图。
二维数据(2D Data)：液质联用中, 只包含色谱图的数据, 例如用SIR ，MRM 方式采集的数据（没有质谱信息）。
三维数据(3D Data)：液质联用中, 同时包含色谱图和质谱图的数据, 例如用Full Scan方式采集的信息（有质谱信息）。
分子离子：分子失去一个电子生成的离子,其质荷比等于分子。其质荷比等于分子。
准分子离子：指与分子存在简单关系的离子, 通过它可以确定分子量。例如: 分子得到或失去一个氢生成的离子:(M+H)+ ,(M-H) - 就是最常见的准分子离子。
碎片离子：分子离子裂解所生成的产物离子
母离子与子离子：任何离子进一步裂解产生了某离子, 则前者称为母离子，后者称为子离子。
单电荷离子与多电荷离子：只带一个电荷的离子叫单电荷离子,带两个或两个以上电荷的离子叫多电荷离子, 它们时常具有非整数质荷比。
同位素离子：由元素的重同位素构成的离子叫作同位素离子, 它们在质谱图中总是出现在相应的分子离子或碎片离子的右侧。
氮规则：当化合物不含氮或含偶数个氮原子时,该化合物的分子量为偶数,当化合物含奇数个氮原子时, 该化合物的分子量为奇数。API电离方式使用氮规则时要将准分子离子还原成分子量后再使用。
全扫描 (Full Scan)：检测一段质荷比范围离子的采集方式，由每个采样点提取一张质谱图。
扫描时间(Scan Time)：Full Scan 方式采集数据的参数, 单位为秒,表示四极杆扫描某一范围质荷比离子的时间。
扫描延迟时间(Inter Scan Delay)：Full Scan 方式采集数据的参数, 单位为秒,表示两次扫描之间的间隔。
选择离子监测(Selected Ion Record,SIR)：选择能够表征某物质的一个质谱峰进行检测。
驻留时间 (Dwell Time)：SIR 方式采集数据时的一个参数, 单位为秒,表示四极杆放行该离子的时间。
多反应检测 (Multiple Reaction Monitoring,MRM)：串联质谱的一种采集方式, 同时以SIR方式检测母离子与子离子, 特点是高选择性和高灵敏度相结合,适用于痕量目标监测物的定量分析。
EI:电子轰击电离源
FAB：快原子轰击电离源
ESI：电喷雾电离源
APCI：大气压化学电离源
API:大气压电离源，泛指ESI和APCI
MAIDI：基质辅助激光解析电离源
分辨率：在给定样品的条件下，仪器对相邻两个质谱峰的区分能力。
灵敏度：在规定条件下，对选定化合物产生的某一质谱峰，仪器对单位样品所产生的响应值，试验中常以信噪比表示。
信噪比（S/N）：谱峰信号强度与噪音强度的比值。
质量范围（Mass range）：质谱仪器能测量的离子质量下限与上限之间的范围。

质量歧视效应：质谱仪器中一些部件，如质量分析器、离子检测器，对不同质量的离子产生偏差响应的现象。

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