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不同酒曲的黄酒发酵过程中挥发性成分的变化研究

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2018/10/17

私聊

食品常规理化分析

摘要：本实验通过吹扫捕集样品在线处理法与气相色谱-质谱联用仪分析其挥发性成分，根据峰面积外标法计算含量。从各发酵阶段中提取12种含量大于0.001mg/L的主要挥发性成分，含量占总挥发性成分的82.69%。结果表明，生料黄酒中丁二酸二乙酯、乳酸乙酯、5-甲基呋喃醛、羟基丙酮和5-甲基糠醛基本不存在或含量极少，前四种是构成黄酒气味令人愉悦的风味物质。具有较大刺激性的甲酸基本不存在于熟料黄酒中。这表明生料酿制黄酒的风味在很大程度上不如传统方法酿制的黄酒。
黄酒是世界上最古老的酒类之一，距今已有6、7千年的历史。名列为世界三大古酒之一，且唯中国独有。其香气浓郁、口感醇和，具有活血祛寒、抗衰老等功效。由于酿造工艺的不同，黄酒种类繁多，风味各异。广大的黄酒爱好者对这一产品的需求也随着人们日益提高的生活水平而不断变化着，从其口感到其营养价值，甚至是构成其特殊风味的微量成分逐渐引起消费者的关注。作为黄酒的主要组成成分之一的挥发性物质，其变化是导致黄酒的风味随着贮存年份的增加逐渐改善的主要因素。但目前的大部分研究是针对成品酒的，对于黄酒酿制阶段中风味物质的含量变化研究甚少，所以选择合适的研究方法和技术来分析不同酿制阶段挥发性物质的组成及变化非常有必要，对黄酒的酿制和生产具有重要意义。
黄酒发酵工艺主要有熟料发酵和生料发酵两种。熟料发酵，是以糯米为原料，通过蒸煮后，经麦曲、酒药中多种有益微生物的糖化发酵作用，酿制而成的一种低酒度的发酵酒；而生料发酵是一种不需蒸煮原料而直接利用生淀粉发酵产酒的酿酒技术，具有操作简便，便于工业化生产，节约能源，提高原料出酒率等优点，成为国内外研究的热点。生料发酵技术随着我国活性酿酒干酵母的问世和糖化发酵剂生产水平的提高，得到新的发展，通过选择合适的发酵菌剂，酿制的黄酒风味与传统工艺生产的并无二致，使得生料发酵成为我国黄酒工业发展的方向。
吹扫捕集也称动态顶空，是用流动气体将样品中的挥发性成分“吹扫”出来，再用一个捕集器将吹扫出来的有机物吸附，随后经热解吸将样品进行分析检测的方法。已应用在水和葡萄酒中微量挥发性成分检测。吹扫捕集法适用于将沸点低于200℃的半挥发性或挥发性化合物从液体或固体中萃取出来，这种处理方式不需要使用有机溶剂，并且只需要取少量样品，就能取得高效率的富集，特别是对环境不造成二次污染。广泛应用于生物分析、食品与环境监测等部门。将吹扫捕集技术应用于黄酒的挥发性成分测定，在国内外鲜有报道。
本文用吹扫捕集分析法与气相色谱-质谱联用法对生料和熟料两种发酵过程中的发酵液挥发性成分进行定性鉴别和定量分析以及对比研究。旨在揭示不同酒曲酿制黄酒中挥发性成分的差异，以期为选择黄酒酿造原料，完善酿酒工艺，提高酒的质量提供一定的理论依据。
1 材料试剂与方法
1.1 实验材料
生料酒曲、熟料酒曲、糯米，购于粮油批发市场。
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1主要试剂
糠醛、异戊醇、乙酸、乙酸乙酯（均为色谱纯），无水乙醇、乳酸
1.2.2主要仪器
7890A/5975C 气相色谱- 质谱联用仪（美国安捷伦公司），色谱柱DB-WAX （30 m×0.32 mm×0.25 μm），AQUATeK100液体自动进样器，Tekmar 9800 Stratum Teklink 吹扫捕集浓缩仪，恒温水浴锅，双人单面净化工作台，恒温培养箱，立式压力蒸汽灭菌器，高速离心机、分析天平等。
1.3 实验方法
1.3.1传统方法和生料法酿制黄酒
熟料法酿造黄酒，将糯米用蒸馏水浸泡12 h，沥干水分后用透气的纱布包裹用锅蒸熟，将蒸熟的糯米置于干燥的竹编上晾凉，称取200 g熟糯米和26 g熟料酒曲于灭菌后的发酵瓶中，加入300 mL无菌水后拌匀。
生料法酿制黄酒，称取200 g生糯米于灭菌后的发酵瓶中，加入10 g生料酒曲，再加入300 mL无菌水拌匀。
按上述步骤生熟料法各配制25瓶，置于28℃恒温条件下发酵。
1.3.2黄酒发酵醪液采集
提取传统方法和生料法酿制的黄酒发酵天数分别为 2、4、7、10、17和24 天时的黄酒发酵醪液。两种方法每次随机取三瓶，每瓶取2次样品作为平行组，分别取40 mL醪液于新离心管中。所有酒样当天采集完后立即放入-20 ℃冰箱保存备用。
1.3.3标样溶液配制
准确称取一定量各标准品溶解到无水乙醇中，配制成标准储备液，再加入到模拟黄酒中配制成一系列质量浓度的标准溶液。模拟黄酒采用超纯水配制，其中含有2.5g/L乳酸和体积分数16%的乙醇。
1.3.4样品前处理
采集的黄酒样品解冻后在高速离心机上以5000r/min的速度高速离心5min，用无菌注射器和水相针式滤器进行过滤，每个样品取20 mL过滤好的酒样于顶空进样瓶，加20mL超纯水进行稀释，摇匀后，放置于自动进样器上，精确吸取稀释样品5.0 mL 进行分析测定。
1.3.5挥发性成分分析条件
吹扫捕集条件：捕集温度30 ℃；吹扫时间20 min；空吹1 min；预解吸温度为185 ℃；解吸温度190 ℃；解吸时间2 min；烘烤温度210 ℃；烘烤时间10 min。
气相色谱条件，色谱柱型号为DB-WAX ( 30 m×0.32 mm×0.25 μm) ；载气为高纯氦气， 10 psi；柱温: 以35 ℃的初始温度保持5 min 后，以5 ℃/min 的速度升至130 ℃，保持5 min，再以10 ℃/ min 升至250 ℃，保持5 min，流速1.0 mL/min。
MS条件，接口温度280℃，四极杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，电离电压70 eV，分流比50:1； EI 源；采用全扫描模式(SCAN)，质量扫描范围为30～550u。
1.3.6挥发性成分的定性定量分析
定性分析：未知化合物质谱图经计算机和人工与NIST 15.L Database（Agilent Technologies Inc.）谱库进行比对，根据特征碎片离子质谱图及保留时间确认其化学成分。
定量分析：将标样配制成已知含量的乙醇标准溶液后，分别取 5 个质量浓度梯度的乙酸乙酯、糠醛、乙酸、异戊醇标准物质混合液，用GC-MS进行分析。以浓度为X轴，峰面积为Y轴绘制标准曲线，通过峰面积外标法进行定量，对于黄酒中的其他芳香组分采取就近原则，即以离组分最近的标样进行定量。
2 结果与分析
2.1生料黄酒与熟料黄酒发酵24d挥发性成分的GC-MS总离子流图

生、熟料黄酒发酵24d挥发性成分的GC-MS总离子流图如图1、图2所示。

2.2 生料黄酒与熟料黄酒发酵各阶段主要挥发性成分分析
据GC-MS分析，从传统黄酒和生料黄酒6个不同酿制阶段酒样中共提取出12种含量大于0.001mg/L的挥发性成分进行分析，分别为5-甲基呋喃醛、甲酸、羟基丙酮、苯乙醛、5-甲基糠醛、异戊醇、乙酸、2,3-丁二醇、丁二酸二乙酯、乙酸乙酯、丙三醇、乳酸乙酯，总含量占所有挥发性成分的82.69%，是生、熟料黄酒中的主要挥发性成分。生、熟料黄酒发酵各阶段主要挥发性成分GC-MS分析结果如表1、表2所示。

表1 生料黄酒发酵各阶段主要挥发性成分GC-MS分析结果

保留时间（min）	化合物	分子式	分子量	含量（mg/L）
保留时间（min）	化合物	分子式	分子量	2d	4d	7d	10d	17d	24d
21.031	5-甲基呋喃醛	C₆H₆O₂	110.11	0.002	0.989	0.664	0.405	0.246	0.192
20.619	甲酸	CH₂O₂	46.03	0.005	0.007	1.358	1.532	2.538	2.069
16.604	羟基丙酮	C₃H₆O₂	74.08	N.D.	0.006	0.015	0.01	0.037	0.103
30.909	苯乙醛	C₈H₈O	120.15	2.996	5.798	9.238	10.628	13.256	12.842
38.827	5-羟甲基糠醛	C₆H₆O₃	126.11	0.036	0.002	0.001	0.001	0.001	0.517
12.758	异戊醇	C₅H₁₂O	88.15	0.003	16.952	2.906	2.018	1.421	0.002
19.222	乙酸	C₂H₄O₂	60.05	0.001	7.698	6.043	5.257	6.417	0.001
20.898	2,3-丁二醇	C₄H₁₀O₂	90.12	0.001	2.481	4.124	5.481	9.198	9.814
23.632	丁二酸二乙酯	C₈H₁₄O₄	174.19	0.012	0.003	0.122	0.248	0.503	0.794
2.65	乙酸乙酯	C₄H₈O₂	88.11	0.343	11.439	15.765	15.172	13.766	0.005
37.348	丙三醇	C₃H₈O₃	92.09	0.514	80.117	1.106	2.019	1.986	0.762
16.726	乳酸乙酯	C₅H₁₀O₃	118.13	N.D.	0.032	0.025	0.016	0.043	0.068

注：“ND”为未检测到该物质

表2 熟料黄酒发酵各阶段主要挥发性成分GC-MS分析结果

保留时间（min）	化合物	分子式	分子量	含量（mg/L）
保留时间（min）	化合物	分子式	分子量	2d	4d	7d	10d	17d	24d
21.031	5-甲基呋喃醛	C₆H₆O₂	110.11	8.627	3.289	1.863	1.272	0.981	0.827
20.619	甲酸	CH₂O₂	46.03	0.009	0.007	0.009	0.066	0.005	0.025
16.604	羟基丙酮	C₃H₆O₂	74.08	0.001	0.826	0.762	0.095	0.276	0.068
30.909	苯乙醛	C₈H₈O	120.15	1.253	8.08	5.346	6.88	5.181	8.729
38.827	5-羟甲基糠醛	C₆H₆O₃	126.11	3.899	2.289	1.073	0.985	0.569	0.653
12.758	异戊醇	C₅H₁₂O	88.15	0.001	12.41	5.361	6.934	1.249	6.671
19.222	乙酸	C₂H₄O₂	60.05	5.223	8.486	8.983	10.21	11.182	11.78
20.898	2,3-丁二醇	C₄H₁₀O₂	90.12	4.571	16.594	16.292	18.139	27.669	28.895
23.632	丁二酸二乙酯	C₈H₁₄O₄	174.19	0.012	2.390	8.530	15.796	27.675	26.618
2.65	乙酸乙酯	C₄H₈O₂	88.11	1.141	2.839	4.859	5.727	6.272	8.043
37.348	丙三醇	C₃H₈O₃	92.09	6.057	4.92	34.405	11.883	11.396	8.484
16.726	乳酸乙酯	C₅H₁₀O₃	118.13	0.006	5.786	12.395	5.064	3.260	6.291

2.3主要醇类含量及变化趋势
醇类是黄酒挥发性成分中含量最多的化合物，多以呈味为主，但也有呈香作用。醇作为酯类形成的基础物质，可以提高酒中的酯类香气。生熟料黄酒不同酿制阶段主要醇类含量及变化趋势如图3-图5所示。
如图3所示，生料黄酒和熟料黄酒在酿制过程中，2,3-丁二醇含量随着发酵的进行持续增多，且熟料中2,3-丁二醇的含量高于生料黄酒。
丙三醇（又称甘油）具有甜味和粘稠性，是酒的主要组成分，对酒的质量具有重要影响。黄酒中经常会添加甘油，增加酒的浓稠度，而黄酒发酵本身就能产生甘油。如图4所示，随着发酵天数的延长，生料和熟料中的丙三醇相对含量均呈先增多后减少趋势，之后趋于平稳。在发酵前期，生料中的丙三醇多于熟料，发酵后期则相反。
异戊醇具有典型杂醇油气味和酒头香，刺舌、稍涩，捎带苦杏仁味。如图5所示，生料和熟料黄酒中的异戊醇相对含量在发酵过程中均呈波动性变化，且含量相差不大。

图3 2,3-丁二醇的含量变化趋势 图4 丙三醇的含量变化趋势

图5 异戊醇的含量变化趋势图6 乙酸乙酯的含量变化趋势

2.4主要酯类含量及变化趋势
酯类是构成黄酒风味的主体，使得黄酒香气浓郁而醇和。由于黄酒酿制过程中形成了繁多的醇类和酸类，所以生成的酯也是多样的。生熟料黄酒不同酿制阶段主要酯类含量及变化趋势如图6 -图8所示。
乙酸乙酯有强烈的果香和酒香香气，并有苹果、菠萝的香气，带涩，乙醚状新鲜香气。赋予黄酒清新、飘逸之感。如图6所示，乙酸乙酯含量在生料黄酒发酵7天时达到最大，之后随发酵进行而减少。而熟料中乙酸乙酯含量在24天的发酵期内呈持续增多趋势。
丁二酸二乙酯呈微弱的令人愉快的香气。如图7所示，其含量在生料黄酒中较少，但随发酵进行有增多趋势。在熟料黄酒中持续增多，由于其在发酵24天时趋于平稳。
乳酸乙酯香味弱味微甜，淡时呈优雅的黄酒味，适量有浓厚感，量多则带苦涩，过浓时青草味，是构成黄酒风味物质主要成分之一。如图8所示，生料黄酒中乳酸乙酯含量极少，熟料黄酒中乳酸乙酯含量高于生料，且其含量在发酵过程中呈波动性变化。

图7 丁二酸二乙酯的含量变化趋势图8 乳酸乙酯的含量变化趋势

2.5主要酸类含量及变化趋势
俗话说，“无酸不成味”，酸类是黄酒成香的重要组分。它的少量存在，对香味成分起缓冲作用，能与其他香味物质共同组成酒固有的芳香。挥发性有机酸是构成就的“后味”的重要物质。酸类是随着酒精发酵而产生的，当酒醅在发酵温度过高这样不正常条件下发酵，酸类物质就会增加。生熟料黄酒不同酿制阶段主要酸类相对含量及变化趋势如图9、图10所示。
甲酸味微酸，较甜，刺激性较强。如图9所示，其在熟料黄酒中含量极少，而生料黄酒中甲酸含量随发酵进行大致呈现持续增多趋势。
乙酸具有醋酸味和刺激感，微酸甜，爽口。如图10所示，随着发酵时间的延长，熟料黄酒中的乙酸含量稳步增长，而生料黄酒在发酵到第2天时，乙酸含量有一个陡增，之后趋于稳定。

图9 甲酸的含量变化趋势图10 乙酸的含量变化趋势

2.6主要醛类含量及变化趋势
微量的醛类可以增加芳香，但同时也是造成辛辣和刺激性的主要成分。生熟料黄酒不同酿制阶段主要醛类含量及变化趋势如图11-图13所示。
苯乙醛的香气类似风信子，经稀释后具有水果的甜香气。如图11所示，随着发酵的进行，生料黄酒中的苯乙醛含量稳步增长，而熟料黄酒在发酵到第2天时，苯乙醛含量有一个陡增，之后呈波动趋势。
5-甲基呋喃醛是一种助香成分，本身没有风味。如图12所示，5-甲基呋喃醛含量在熟料黄酒发酵过程中呈减少趋势，且在发酵前期减少较快。其在生料黄酒中含量较少，且随发酵进行含量变化不大。
6-甲基糠醛似苦杏仁味，糠味，有香蕉糊气味，带苦涩感。如图13所示，其几乎不存在于生料黄酒中，在熟料黄酒中随发酵进行含量呈减少趋势。

图11苯乙醛的含量变化趋势图12 5-甲基呋喃醛的含量变化趋势

图13 5-甲基糠醛的含量变化趋势图14 羟基丙酮的含量变化趋势

2.7主要酮类含量及变化趋势
酮类不属于风味物质，但少量短链的羰基化合物具有令人愉快的甜香气味。如图14所示，羟基丙酮几乎不存在于生料黄酒中，而在熟料黄酒中含量大致呈现先增多后减少趋势。
3 讨论
3.1生熟料黄酒酿制过程中主要挥发性成分的变化
挥发性风味成分的组成变化可以在一定程度上反映黄酒的加工方式。研究表明，生料黄酒中2,3-丁二醇、丁二酸二乙酯、甲酸、乙酸、苯乙醛含量在发酵过程中呈持续增长，而丙三醇、乙酸乙酯、5-甲基呋喃醛含量随发酵进行先增多后减少。
熟料黄酒中2,3-丁二醇、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸、苯乙醛的含量随发酵进行呈持续增多趋势，而5-甲基呋喃醛和5-甲基糠醛含量呈持续减少趋势，丙三醇和羟基丙酮含量随发酵进行先增多后减少。熟料黄酒中大部分醇类、酸类和酯类含量呈上升趋势，而醛类、酮类含量呈减少的趋势，这与李红蕾等人在黄酒酿制过程中风味物质变化规律研究中的结果不一致，李红蕾等人的研究结果为大部分酯类、酸类和醛类物质的含量随酿制阶段呈现减少的趋势。这可能是由于选择的发酵期或者酿制工艺不同导致。丙三醇和异戊醇含量分别在发酵第7天和第4天就达到顶峰，这与胡健等人在黄酒发酵过程中主要香气成分的变化研究相似。胡健等人发现异戊醇等高级醇在发酵前期其浓度就达到一个顶峰，之后浓度都略低于最高点。另外，他们发现醛类在发酵过程中会迅速降低到极低的浓度，而酯类在发酵过程中含量逐渐升高，这些都与本实验结果一致。
3.2生料黄酒与熟料黄酒中主要挥发性成分差异
由于酿造原料和工艺的不同，会使黄酒中挥发性成分的种类和含量产生一定的差异。本文建立的吹扫捕集与气相色谱-质谱联用技术测定生、熟料黄酒中挥发性成分，对12种主要挥发性成分进行了分析。研究表明，丁二酸二乙酯、乳酸乙酯、5-甲基呋喃醛、羟基丙酮和5-甲基糠醛基本不存在于生料黄酒中或含量极少，而前四种物质是构成黄酒气味令人愉悦的风味物质。生料中存在的甲酸含量很高，具有强烈刺激性，但在熟料中含量极少。这表明本实验生料酿制黄酒的风味在很大程度上不如传统方法酿制的黄酒，可能是曲种和工艺的选择不当导致。我国对生料酿酒的研究始于20世纪70年代末，直到20世纪90年代才进入快速发展期^[¹⁸^]。生料法从21世纪初期开始逐渐被应用于实际生产，其势头发展迅猛。侯振建^[¹⁹^]等改善了生料法酿造糯米黄酒的发酵工艺及其条件，发现将6%的生料曲和3%的麦曲接入原料中，于26℃ 左右进行发酵，可得到低酒度低糖的新型黄酒。岳春^[²⁰^]等论述了液态生料法酿造玉米黄酒的可行性，并研究出了糖化发酵的条件。采用高低温间隔法酿酒，不仅极大地缩短了酿酒时间，并且提高了原料利用率。史路路^[²¹^]等通过在用糯米酿造生料黄酒中添加葛根，确定了新型生料黄酒的酿造条件。这些研究都证明了生料酿酒的优越性和可行性，生料酿酒前景看好。
4 结论
通过GC-MS技术对生、熟料黄酒中的挥发性成分分析发现丁二酸二乙酯、乳酸乙酯、5-甲基呋喃醛、羟基丙酮和5-甲基糠醛基本不存在于生料黄酒中或含量极少，前四种是构成黄酒气味令人愉悦的风味物质，有刺激性气味的甲酸含量则远高于熟料，表明本次实验的生料黄酒风味不如熟料黄酒。通过查找文献，发现目前对生料法酿造黄酒研究的报道还较少，究其原因是没有解决生料酿酒的曲种问题。现生料酿酒工艺中所使用的生料酒曲是多功能微生物复合酶酒曲，其发酵剂主要是高活性酵母，菌群较为单一，其代谢产生的物质相对简单，不仅醇、酯、酸比例失调，出现醇、酸含量高而酯含量低的两高一低现象，而且杂味严重，存在糖化酶味、中药味和生味，从而影响产品的风味和口感。而利用红曲、麦曲等传统酒曲进行熟料酿制的黄酒口感温润，风味醇厚。如果能从迎合消费者对黄酒产品的风味和口感需求出发，从源头上改良黄酒生料曲的菌群构成，同时通过改进工艺来解决诸如发酵周期偏长、酒体稳定性差、成品酒易酸败等生料酿酒问题，提升生料酿制黄酒的品质，是关系到生料酿酒工业能否推广和持续发展的瓶颈问题，可作为未来的研究方向。

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