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【仪器故事】昙花一现的NASBA-ECL

栀子花开

2018/10/24
分析者端木精英队

食品常规理化分析

【仪器故事】昙花一现的NASBA-ECL

1背景
以下内容摘自百度文库（链接地址：https://wenku.baidu.com/view/16614297daef5ef7ba0d3c93.html）
NASBA（Nucleicacidsequence-basedamplification）技术是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术，这项技术特别适用于RNA分子的检测。其特点是整个扩增过程在恒温条件下进行，因此不需要特殊（如PCR仪）的控温装置，大大避免了PCR扩增过程中复杂的温度变化。借助NASBA技术平台，开发了世界上第一个成熟而广泛适用的禽流感早期快速诊断系统。此系统包括对禽流感各亚型包括高致病性病毒的特异性检测，为世界上多个国家地区用于禽流感的早期常规筛查和疫情防控，推动了国内外禽流感疫情监控的发展。该技术平台技术以NASBA病毒检测系统为中心，在确保高灵敏度、高准确率的前提下，使检测周期缩短至半天；且无需特殊的昂贵仪器，检测人员无需特殊技能；它是一个速度快、成本低并且实现了全自动检测的诊断系统，更重要的是此高效灵敏的设备适用于资源有限的高感染区，如：条件落后的基层偏远地区。这些地区也往往是疫情爆发的最前沿。该技术的应用显著减少了大面积筛查时的工作量和成本。
由于该技术是恒温扩增，加上标准化的操作步骤，使不同实验室所得实验结果具有很高的可比性。NASBA技术平台的优越性包括：
1.NASBA不会受到抗体存在的影响，能够区分接种疫苗的生物体中目的病毒存在与否。
2.NASBA在禽流感检测中能够区分致病菌株和非致病菌株。
3.对禽流感H5N1病毒的检测，已经充分的证明：NASBA的灵敏度可以与病毒检测“金标准”——病毒分离法相媲美。
4.与NASBA相比，病毒培养方法操作繁琐、实验时间长，操作严格。即使熟练的技术人员至少需要14天的时间完成整个过程。
5.使用NASBA技术，在最适实验条件下15小时能够扩增10¹²倍，远远高于PCR的10⁹倍的扩增效果。
实验结果显示，NASBA技术比目前商品化的免疫检测试剂盒敏感至少1000倍，比常规PCR方法也敏感许多，与现行的病毒培养的检测方法灵敏度相当。但是病毒培养通常需要至少几天以上的时间才能得到结果，而NASBA技术常规仅需要4-6小时就可以准确地得到结果，便于尽早采取防治措施。英国与联合国兽医参考实验室(VeterinaryLabAgency)合作并验证，采用NASBA技术对来自不同地区、不同时期爆发的禽流感病毒进行检测，结果显示，NASBA-H5、NASBA-H7、NASBA-AIV均可准确无误地检出病毒。NASBA技术操作简便，自动化水平高，可以减少人为造成的误差。而且还是一种高通量方法，可以同时检测50个样本，非常适用于大规模样品的筛查，节省基层使用时的检测成本。NASBA技术的扩增产物为RNA分子，使用者可以根据需要选择不同的检测方法，如电化学发光法和酶联法等。而且，与PCR的产物DNA分子不同，RNA分子不易对实验仪器和环境造成污染，避免了产物交叉污染实验仪器、操作环境导致的假阳性结果。适用于NASBA技术的样品范围很广，除动物组织，血液、体液样本外，还可对环境样本进行监测，如禽类饲养场所、交易场所、运输工具等等，因此为监测和控制禽流感的传播提供了有效的依据和手段。
2动机
2004年国内发生多起高致病性禽流感疫情，给国人的健康及畜牧业的发展带来了严重威胁，不仅家禽发生疫情，同时也有人感染病例。在此情况下，如何快速诊断禽流感疫情摆在面前，经过调研初步定下两套方案：
第一套方案：传统的PCR扩增系统，采购全进口的PCR仪+电泳仪+凝胶成像系统，约需40万元，意向品牌为BIO-RAD，当时系统为较为流行的品牌的配置；如果增加核酸提取系统，约需增加30万元。
第二套方案：新型的NASBA扩增系统，当时有些疾控中心采购了该系统，据说效果不错，整套系统68万元。
两套方案各自其优缺点：
PCR系统灵敏度较低，但试剂采购方面较为灵活，既可以采购商品化的试剂盒，也可以采购各单品种试剂自行配制混合液；同时可利用的检测标准很多，可委托生物工程公司合成引物后开展多个项目的检测，拓展性很好。
NASBA系统灵敏度很高，据业务代表称可以将5~10份样品混合成1份检测，相对来说单个样品的检测成本更低。但只能采购商品化的试剂盒，拓展性不好，可利用的检测标准也只有禽流感一个系列。
两套方案都有支持者，最后老大拍板决定还是购买更先进的NASBA。
3蜜月
2005年设备终于采购到位，到了好几大箱的东西，除了ECL化学发光阅读器外，还有干燥箱、水浴锅、移液器和几个试剂盒。安装时问了工程师才知道，原来干燥箱、移液器都是用于核酸提取的，水浴锅是用于扩增的，ECL化学发光阅读器是用于检测的。操作流程简述如下：
3.1核酸提取
3.1.1原理：样品中加入裂解液使RNA游离，加入硅土进行吸附，然后洗去杂质，最后加入洗脱液将硅土中的RNA洗下。
3.1.2实际操作：
裂解：向0.1mL样品（如拭子上清液）中加入0.9mL裂解液混匀；
吸附：加入0.05mL硅土悬浮液混匀，室温孵育10 min，以12000r/min离心30 s，移去上清；
洗涤：加入1 mL洗涤液混匀，以12000 r/min离心30 s，移去上清；加入1 mL70%乙醇混匀，以12000r/min离心30 s，移去上清；加入1mL70%乙醇混匀，以12000 r/min离心30 s，移去上清；加入1 mL无水乙醇混匀，以12000 r/min离心30 s，移去上清；
干燥：将离心管敞口置于干燥箱内，56℃干燥10min；
洗脱：每管加入0.05 mL洗脱液并混匀，56℃孵育10min；以12000 r/min离心2 min，将上清转移入另一支离心管，即为所提取的核酸。
3.2核酸扩增
3.2.1原理：NASBA体系中含有T7RNA聚合酶、RNaseH、AMV逆转录酶、NTP、dNTP、引物（P1和P2）以及反应缓冲液。NASBA整个反应分为两相：非循环相和循环箱。在非循环相，引物P1与模板RNA退火，AMV逆转录酶催化合成一条cDNA链，形成RNA-DNA杂交分子，RNaseH水解杂交分子上的RNA，留下一条单链DNA。引物P2随后与这条DNA链的5’末端退火，AMV逆转录酶催化合成第二条DNA链。T7RNA聚合酶识别双链DNA中的启动子区，催化DNA转录为RNA，由每一分子可产生100拷贝RNA。新合成的RNA进入循环相，成为反转录的模板。它们首先与引物P2结合，由AMV逆转录酶催化合成一条DNA链，形成RNA-DNA杂交分子，RNaseH水解RNA，留下一条单链DNA，引物P1退火，逆转录酶再催化合成一条新的含有T7RNA聚合酶启动子的DNA片段，T7RNA聚合酶再以此DNA为模板成更多拷贝的RNA，如此循环反复，RNA拷贝数被不断放大。
3.2.2实际操作：
向试管中加入5μL核酸、10μL扩增试剂，于65℃孵育5min；取出于41℃孵育5min；然后加入5μL酶溶液并混合均匀，继续于41℃孵育5min；取出试管稍作离心，继续于41℃孵育90min。
3.3检测及判定
3.3.1原理：扩增产物可利用ECL化学发光技术进行检测。扩增反应完成后，用生物素标记的捕获探针和5’标记有电化学发光剂（TAG）的ECL检测探针与RNA产物共同作用形成复合物，被寡核苷酸饱和的磁珠携带到电极处，低电压作用下钌离子的氧化还原反应可产生光子。然后在TPA作用下，钌离子再生。因为在此过程中产生光信号的强度与吸附于电极的RNA产物正相关，所以用电化学反光检测仪测定620nm处的发光强度可对RNA定量。
3.3.2实际操作：
取（N+2）个5mL聚丙烯试管进行编号，其中1号作参照，2号作试剂空白；
除1号管外，各加入杂交溶液20μL；
2号管加入检测稀释液5μL，其余管各加入扩增产物5μL，封口膜封管，振荡混合；
所有试管于41℃孵育30min；
除1号管外，其余试管各加入分析缓冲液0.3mL；
振荡仪器调试参照液至不透明，然后加IRS 0.25mL至1号管；
将所有试管放入进样器，建立程序开始检测；
判定：测定值/仪器参照液读数≥0.15，判定为阳性；否则判定为阴性。
3.4体会
对于初涉分子生物学的菜鸟，NASBA技术确实比较方便，一是扩增不需要昂贵的设备，只需要2个水浴锅即可；二是检测实现了自动化，只需将反应体系配制完成后，放进进样器，建立程序即可自动检测；三是扩增效率确实比较高，我们曾经在10份样品制成的混样中检出阳性样品，后来对这10份样品进行逐一检测，其中也只有1份样品是阳性的。
4龃龉
使用了一段时间后，也发现了NASBA存在一些问题，诸如：
4.1对环境温度要求非常严格。仪器说明书上写明使用温度为15℃~25℃，一开始以为是推荐值，后来发现这玩意儿在玩真的，室温一旦超过临界值，仪器就报警且停止工作，除非将室温调整到该范围内。从此以后，只要在夏天或冬天开展NASBA检测，我们就必须至少提前数小时将检测室空调打开，否则根本玩不转。
4.2检测速度慢。经测试，NASBA检测一个样品需1.5min，对于检测几个样品来说影响不大，但在大规模筛查时就不一样了。我们有一次检测300份样品，以5:1混样，实际检测60份混样，为了判定参照液是否稳定，特地在最后一份样品后安排了一次测试，结果发现测试值居然只有最开始的60%左右。向厂方提出疑义，答复是NASBA的灵敏度非常高，一般的样品要么测试值非常低（阴性样品），要么测试值非常高（阳性样品），参照液测试值下降不影响最终结果的判定。尽管实际检测也未发现有临界值样品，但心中总是留下一个疙瘩。
4.3软件界面简陋。仪器是2005年购入的，当时Windows XP已发布4年，而随机软件居然还是DOS版本，操作相当不便。
4.4扩展性不强。当时配套的试剂仅有禽流感、蓝耳病等几个病种，远不如PCR试剂丰富，而且检测标准也只有GB/T 19439-2004《H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法》及GB/T19440-2004《禽流感病毒NASBA检测方法》，实验室想在NASBA检测项目上通过认证非常困难。
5分手
2007年国内蓝耳病疫情频发，为了摸清本地疫情情况，准备开展一次大规模检测，采样数量500份左右，需要2个检测试剂盒。向区域代理下了订单后，久久等不到试剂，反复沟通打了不下几十个电话才搞清楚，原来NASBA试剂的订购流程如下：客户向区域代理下单——区域代理每周一次向国内总代下单——国内总代向香港工厂下单——香港工厂接单后安排生产——香港工厂进行质量检测合格后将试剂发给客户。一开始我对这个流程还是有些不相信的，不过等了将近两个月接到HK Express的快递后，我才不得不相信这些试剂真是香港直接寄过来的！
众所周知，疫情来了那就如消防队员扑灭火灾一样，实验室必须在接到样品后的第一时间开展检测，但大陆居然没有NASBA试剂的现货，一盒都没有，我求爷爷求奶奶让他们提供一盒应急，居然也没有！他们都是在接到客户订单后，然后通知工厂按订单生产的，前后耗时近两个月！如果真的发生疫情，这台仪器又能起什么作用！
基于NASBA试剂的供应流程之慢，我们只能将这台只用了两年，耗资68万元的NASBA系统束之高阁，另外建立PCR平台开展实验，这也是我从事实验室工作近20年遇到的设备采购中最遗憾的一件事。

最后的几句话：写下此文，我的心情是比较低沉的，初衷并不是想贬低设备，出自国际大品牌的设备自有其优越性，但由于试剂供应的问题，目前在我们行业几乎均是束之高阁，很令人遗憾。希望厂家能改进试剂生产供应流程，增加品种，焕发昔日荣光。最后附上一张该设备的照片，纪念那逝去的十年光阴。

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symmacros

第1楼2018/10/24

应助达人

这个设备价格不菲，但系统怎么更新慢呢？

0

沧海青城

第2楼2018/10/24

应助达人

也是不容易啊

0

WUYUWUQIU

第3楼2018/10/25

应助达人

技术上的提升是必要的

0

影子

第4楼2018/10/25

好高深的技术

0

zyl3367898

第5楼2018/11/02

应助达人

因为没有试剂，仪器闲置，真可惜。

0

栀子花开

第6楼2018/11/03

应助达人

确实很可惜，但厂家也因此失去了一批优质客户

0

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