液相色谱塔板高度方程的统一形式
戴朝政
（中国科学院成都有机化学研究所，四川 成都610041）
摘要:本文研究了色谱分离过程中物质的径向扩散和流动相发热对柱效能的影响。从热传导方程出发，运用色谱过程动力学原理推导了包括考虑流动相径向传质、色谱柱发热影响的液相色谱塔板高度方程：
这个方程概括了高效液相色谱（HPLC）、超高效液相色谱（UPLC）、毛细管电色谱（CEC）和消滞留层液相色谱（ESFLC）塔板高度与各种因素的关系。方程最后一项代表了径向扩散和柱发热对塔板高度的贡献。当流动相线速度较低时，流动相摩擦生热对塔板高度的贡献趋近于零，塔板高度方程还原成Horvath 和Lin 的方程；当流动相线速度较高时由于流动相摩擦生热，柱轴心与边缘温差增加, 导致流动相线速度径向分布差异柱效率降低，而柱轴心与边缘的温差与流动相线速度平方成正比。作者明确指出：液相色谱的柱效率与柱内径密切相关，采用细内径柱有利于实现高速与高效率；过高的流动相线速度将导致色谱柱效率崩溃。
关键词:高效液相色谱；超高效液相色谱；毛细管电色谱；消滞留层液相色谱；色谱过程动力学；柱效率崩溃；塔板高度方程
Unified form of liquid chromatography plate heightequation
Dai Chaozheng
(Chengdu Institute of Organic Chemistry, Chinese Academyof Sciences, Chengdu 610041, China)
Abstract: In the paper the effects of radial diffusion andmobile phase heating on column efficiency during chromatographic separationwere investigated. Starting from the heat transfer equation, the liquidchromatography plate height equation including the consideration of mobilephase friction and electric heat generation is derived using the principle ofchromatographic dynamicsas follows
This equationsummarizes the relationship between high-performance liquid chromatography(HPLC), ultra-high performance liquid chromatography (UPLC), capillaryelectrochromatography (CEC), and eliminate stagnant fluid layer chromatograph (ESFLC) plateheights and various factors. The last term of the equation represents thecontribution of radial diffusion and column heating to the plate height. Whenthe linear velocity of the mobile phase is low, the contribution of thefrictional heat generation of the mobile phase to the plate height approacheszero, and the equation of the plate height of reduced to the equation ofHorvath and Lin; when the linear velocity of the mobile phase is too high, thefriction heat of the mobile phase occurs. The temperature difference betweenthe axis and the edge of the column increases, resulting in a decrease in theefficiency of the column. The temperature difference between the axis and theedge of the column is proportional to the square of the velocity of the mobilephase. The authors clearly point out that the column efficiency of liquidchromatography is closely related to the inner diameter of the column. The use ofa thin inner diameter column is conducive to high speed and high efficiency;too high a mobile phase line speed will lead to column efficiency collapse.
Key words: High performanceliquid chromatography; Ultra performance liquid chromatography; Capillaryelectrochromatography; Eliminate stagnant fluid layer chromatograph; Chromatographicprocess kinetics; Column efficiency collapse; Plate height equation
通讯联系人. E-mail：Daichaozheng@126.com.
1．前言
液相色谱动力学过程研究一般都没有考虑色谱分析过程中物质径向扩散和流动相发热对柱效能的影响。但是随着色谱技术的发展，色谱柱前压力越来越高，流动相通过担体因摩擦生热导致柱温升高就不可避免了。在以前,由于柱前压力有限，柱内温度的升高通常予与忽略，但是随着色谱技术的发展，UPLC采用了更细粒度的担体和超高的柱前压。流动相通过色谱柱时色谱柱发热就不可以不在乎了。按照能量转换守恒定律，在理想绝热条件下UPLC流动相的摩擦生热升温理论上温度上升可达3～4.5℃。除了摩擦可以生热升温外，现在使用的电色谱（CEC）以及消滞留层色谱(EliminateStagnant Fluid layer Chromatograph )(ESFLC)都要在柱的两端施加电压。电流通过流动相也会发热导致柱温升高。现在，色谱柱发热已经是一不可不研究的现象。一般说来，担体粒度远小于柱内径，流动相在色谱过程中发出的热量在柱断面上可视为是均匀的，由于柱边缘与外界接触可以散热，其结果是柱中心的温度比柱断面边缘要高，形成一个环形与中心对称的温度梯度，或称为温度场。溶液温度高黏度就低，故在柱中心流动相流速快。柱断面边缘流动相流速慢。断面上流速的差异使得柱内传输的物料形成纵向弥散，对分离产生不良的影响，也使塔板高度增加。
色谱过程动力学研究通常是把具有三维空间的色谱柱简化为一维空间看待，只是考虑各种纵向扩散因素对分离效能的影响。实际上，物质柱内的扩散是在三维空间进行的。组分的径向扩散改变了分子在柱内行进的距离与方向，最终造成谱带的弥撒。
上世纪70年代，Horvath和Lin认为在液-固吸附色谱过程中，吸附剂与流动相接触的表面存在着一个滞流层。滞流层由几乎静止的流动相组成，而流动相中的物质在自由扩散的作用下，穿过滞流层与吸附剂表面的物质起到交换的作用。他们命名这个模型为间隙滞流体模型（InterstitialStagnantFluid Model）。在这个模型中，吸附剂被视为均匀的多孔球体，流动相中的组分经过在三维空间的扩散穿过滞流层，引起固定相球粒内部物质浓度的变化。在不考虑径向扩散和柱温升高的情况下，导出了液相色谱塔板高度方程（公式符号意义请见参考文献）：
(1)
在Horvath和Lin的公式中没有考虑在色谱过程中物质的径向扩散和流动相发热升温对塔板高度的影响，在当年这是可以接受的。但随着色谱技术的发展，柱前压力的大大增高和电色谱的发展，柱发热与升温以及物质的径向扩散对塔板高度的影响就不能不考虑了。
在此，笔者从色谱理论和热传导方程出发，推导了包含径向扩散和流动相发热升温因素在内的液相色谱塔板高度方程。这个方程既可以描述传统的HPLC也可以概括UPLC、CEC、ESFLC塔板高度方程。为HPLC、UPLC、CEC、ESFLC的理论研究提供指导方向。
2．基础知识
从道理上讲UPLC、CEC、ESFLC与HPLC除流动相驱动力的大小和方式可能不同，色谱过程并无实质性的差别。因此在色谱塔板高度统一方程中必须在Horvath和Lin的公式的基础上再加上流动相在柱内温度分布场对柱效率的影响和径向扩散对柱效率的影响。
通过色谱理论分析我们知道，塔板高度H具有这样的统计意义，即代表色谱流出曲线与其数学期望值的离散程度。根据概率统计理论，有限个独立随机变量和的方差等于它们方差的和。因此，如果存在n种互相独立的影响色谱区域宽度的因素，总的塔板高度H等于各种因素对塔板高度的贡献Hi之和
（2）
径向扩散与流动相流型有关，流动相流型又与柱内温度分布场有关。如果径向扩散对塔板高度的贡献为
，塔板高度方程应当是在Horvath 和Lin的公式基础上加上
项，而项中应概括温度分布场的贡献。
(3)
关键是我们要求出由哪些因素确定？以及的表达方式。
根据色谱过程动力学理论，塔板高度与扩散系数有关，与相应的径向扩散系数 关系为
（4）
其中为因径向扩散和温度场的存在形成谱带弥散的扩散系数，ν为谱带在柱内移动的速度。以下我们将着重讨论影响的因素。
3．理论推导
径向扩散是在流动相中进行的，因此与流动相流型有关。流动相流型又与柱内的温度分布有关。因此我们首先要考虑色谱过程进行时柱内温度是如何分布的。
3．1 均匀发热无限长度圆柱体内温度场的平衡分布
欲推求
的表达式必须研究柱管内温度场的平衡分布状况。出发点是经典的热传导方程
（5）
其中T为温度（K），f（x,y,z,t）为物体内的热源密度函数。是与热传导率，比热及密度有关的常数（）。考虑到①柱长度z远大于柱内半径r0以及②平衡时间足够长，柱内温度分布已经稳定，上述含时间的三维空间问题可化为二维平面极坐标求解。可解得在均匀内热源情况下温度沿柱截面径向分布函数为
(6)
式中r为离轴心的距离；r0为柱内半径；T0为柱内壁的平衡温度；K为与热强度、热传导系数有关的常数。对于液体溶剂摩擦生热有
(7)
其中为流动相的热传导率； 为流动相黏度；为吸附剂粒度。
柱中心与柱内壁的温差DT=Kr02，与流动相线速度平方成正比.
因电流通过生热有则有
(8)
与电场强度平方成正比，与流动相的热导效率、摩尔电导率有关、摩尔浓度以及流动相在柱断面占有分数有关（由于担体内部的流动相可导电，此处流动相在柱断面占有分数与通常理解的流动相在柱断面占有分数数值上略微不同）。
柱中心与柱内壁的温差DT=Kr02，与电场强度平方成正比。由于流动相线速度与电场强度成正比，因此，柱中心与柱内壁的温差DT=Kr02也与流动相线速度平方成正比.
3.2温度场对谱带弥散的影响
温度场对谱带弥散的影响主要体现在两方面：
（1） 温度的差异导致流动相黏度的变化，从而引起流动相流速径向分布的差异。
在温度差不太大的情况下
(9)
其中η0为流动相的温度为T0时的黏度；ΔT为温差T-T0；α为流动相黏度的温度系数。
考虑到式（6）可知，色谱柱内流动相线速度的径向分布函数为
(10)
由于流动相黏度的温度系数α取值一般为负值，故可见在柱中心（r=0）处流动相流速最快（），柱边缘（）处流动相流速最慢（）
（2） 柱内温度分布的差异可导致组分分配系数的变化，从而引起容量因子径向分布的差异。容量因子与柱温的关系为
（11）
a,b为与分子结构有关的常数。
但实际上公式（11）中的b值较小，而柱中心与柱边缘之间T值变化很有限。因此在本推导过程中可不考虑。
液相色谱组分在柱内移动速度
（12）
从而可知流动相与组分在柱内移动速度差异的径向的分布函数为
(13)
其中常数
（14）
3.3径向弥散系数对塔板高度的贡献
在进入以下讨论前建议读者阅读一下参考文献的内容。一般说来远小于1，因此有
（15）
（16）
以下把上式中u(r),ν(r)简写为u,ν。有
（17）
其中Dr为径向弥散系数，为各种径向弥散因素之和。
ｃ为按比例包含各相的综合浓度；
ε1=（c1-c1*）/c1*为流动相中浓度偏离平衡的分数。
c1*为组分在流动相中的平衡浓度
如果我们能以数学意义上的一个点进样到色谱柱的起始部位，通过色谱柱后这色谱点不但沿轴向扩散形成色谱峰，而且在柱横断面上谱带也由点扩大成一个圆。流动相内的分子扩散、涡流扩散以及担体对流向的阻挡，流动相被迫向径向流动产生的扩散，使得原来在数学意义上的一个点变成一个有体积的椭球（三维）或有面积的圆（二维），这就是径向弥散过程。也就是径向弥散系数Dr的物理意义。
上式经过一次积分得
（18）
再次积分
（19）
因为r等于零时ε1值有限，故。
在r=r0处（即流动相与管内壁界面处）柱内壁与担体接触。因担体粒径远小于柱内径，这种接触是点接触。按数学上的理解，点是无体积、无面积的无穷小量。因此从数学的观点，在的界面可视为仅存在柱壁与流动相。柱壁与流动相之间无物质交换，流动相中浓度偏离平衡的分数=0，即有
（20）
把c2代入（19）式得到
（21）
把谱带的弥散也视为一个扩散输运过程，得到
（22）
为断面上u的平均值，有。表示在柱截面液相占有面积分数的微分，。代入上式，故有
（23）
得到
（24）
注意到为断面上流动相中组分的量
（25）
进一步解得到
（26）
代入公式（4）中
（27）
或
（28）
一般说来远小于1，故此项可以不计，得到
（29）
最后得
(30)
上式右端最后一项代表了径向扩散和温度场对塔板高度的贡献。
关于Dr径向弥散系数，前面已经说到Dr为各种径向弥散因素的系数之和。如果把色谱谱带通过柱后的展宽看成一个扩散过程，整个柱产生扩散效应相当的扩散系数应当满足
即
在流动相线速度不太高的情况下，正是Horvath 和Lin方程描述的塔板高度
有
故把色谱谱带通过柱后的展宽看成一个扩散过程其相当的纵向扩散系数
（31）
如果认为柱内的填充担体是各向均匀的。Dr径向弥散系数应当与纵向扩散系数有关。由于流动相单方向的冲洗，Dr径向弥散系数又会与纵向扩散系数数值不同。设
（32）
为比例系数，其数值与柱结构有关。
将（32）式代入（30）式得到
（33）
此即考虑到径向扩散和热效应的液相色谱塔板高度统一方程。
4． 结果与讨论
径向扩散使得在输运过程中不同分子有不同的路径与路程，进而造成谱带加宽，对塔板高度产生贡献。从（33）式右端最后一项可见径向扩散对塔板高度的贡献与柱内半径（）密切相关，也与色谱过程产生的热效应有关。柱内径越大径向扩散影响越大。
对于UPLC和HPLC，流动相线速度
其中柱前后压力差，为流动相的流量。
在流动相线速度不太高，柱内径不太大的情况下（33）式右边最后一项可以不计，此时公式还原成Horvath和Lin公式：
(1)
而UPLC由于柱前压很高，担体粒径又很细，流动相摩擦生热效应不可忽略。就有
(33)
采用方程（33）计算出来的图形见图1。
图1 （a）用公式（33）计算出来的UPLC塔板高度H与流动相线速度u的关系以及（b）Horvath 和 Lin曲线
Fig. 1 Relationship of UPLC plate height Hand themobile phase velocity u calculated using (a)UPLC formula (33) and (b) Horvath and Lin’s formula
从这个公式看出，特别是在高流动相线速度的情况下细粒径的担体要配上细内径的柱才会实现高效。
DT=Kr02代表柱中心与柱边缘的温差，柱中心与柱边缘的温差与流动相线速度的平方成正比，也与柱前压的平方成正比。流动相线速度增加到一定程度后，温度场对塔板高度的贡献会显现出来。在UPLC过程中，一旦温度场的效应显示出来，塔板高度将随流动相线速度增加而迅速增加。塔板高度随流动相线速度的增加并非线性关系，过高的流动相线速将导致UPLC柱效崩溃。摩擦生热效应给进一步提高分析速度和效能产生了限制。
从这个公式的研究知道，进一步减小担体粒度来提高柱效是可行的，但伴随着的是同时要减小柱内径。我们也可以通过减小柱内径来实现在不影响柱效的前提下扩展流动相线速操作范围,即实现更高的分析速度。
图2，担体粒径与塔板高度方程的关系（示意图）
Figure 2,relationship between the particle size of the support and the plate height equation (schematic diagram)
图3 柱内径与塔板高度的关系（示意图）
图3 Relationship between column inner diameter and the plate height (schematic diagram)
对于CEC来说，流动相线速度
方程（33）中代表了吸附剂颗粒边界上液膜（滞留层）传质阻力对塔板高度的贡献。在CEC过程中，因电渗流的作用固定相表面静止的滞流层的消失，此项的贡献也随之消失。在电渗流作用下流动相甚至可穿透到担体内部，导致方程（33）中也几乎消失，我们记为。有CEC塔板高度方程：
（34）
由于电渗流的作用，使以上各项中的值变小。
姬磊，张维冰等人对电色谱塔板高度方程进行了考察[7，8]，条件如下：P/ACE5010电泳仪和Trisep-2000GV毛细管三用电泳仪。流动相：V(5mmol/Lphosphate(pH9):V(CAN)=20:80，恒温箱温度20°C。自制整体柱[9，10]，柱长30cm,填充长度21cm。紫外检测波长214nm。
为了达到一定的流动相线速度，电色谱使用的电压都比较高，因此公式（34）中值较大，导致柱内径大小对柱效影响特别大。姬磊等人采用内径100m(A)和320m（B）柱进行比较，其结果见图4。柱内径增大柱效急剧下降与理论相符。
图4电色谱毛细管内半径50m(A)和160m（B）柱H/u图形比较
Fig.4 Comparison of H/u patternsin the inner radius of the eletrochromatographic capillary with a radius
of 50μm (A) and 160μm (B)
下图为不同组分做出的H/u关系图。
图5 容量因子对塔板高度的影响.柱内半径50m,其他条件同前。A：苯，B：乙苯，C：丙苯，D：丁苯。
Fig 5 Effectof capacity factor on plate height. The inside radius of the column is 50 um,and other conditions are the same as before. A: benzene, B: ethylbenzene, C:propylbenzene, D: butylbenzene.
四川大学徐小平带领的团队采用非金属材料作ESFLC柱[11，12]，在柱两端施加一适当的电压，令担体表面产生电渗流，从而消除担体表面的滞留层。因此在ESFLC塔板高度公式中可不考虑滞留层的贡献：
（35）
其流动相线速度
ESFLC与CEC区别是，CEC的来自于电渗流的驱动，而ESFLC的主要来自于泵压力。
实验条件为：色谱柱采用35mm*3.5mm 5ODS 带金属螺帽PEEK塑料柱，绿原酸为试样，0.3%甲醇:乙腈（92：8）为流动相，施加不同消滞留电场强度下实测柱塔板高度如下：
图6 消滞留层电场强度与塔板高度作图（宽电压范围）(根据徐小平提供的数据制图)
Fig.6 Eliminate stagnant fluid layerelectric field strength and plate height mapping (wide voltage range)
图7 消滞留层电场强度与塔板高度作图（窄电压范围）(根据徐小平提供的数据制图)
Fig.7 Eliminate stagnant fluid layerelectric field strength and plate height mapping (narrow voltage range)
当电场强度时（上图最左边数据），相当于HPLC的情况，此时塔板高度符合Horvath-Lin方程。由于存在吸附剂颗粒表面滞留层对传质的影响，塔板数较低，总塔板数为1552（塔板高度23微米）。
在柱两端施加消滞留电压后，由于担体表面电渗流的形成滞留层消失，公式（33）中项的贡献也随之消失，由于ESFLC施加的电场强度较低，电渗流还不一定能深入到担体内部。
当电场强度不是太高时（）柱温提高不很明显，可以明显看到消滞留层的效果。最高塔板数达到1795（塔板高度19.5微米）。
继续升高消滞留电场强度（），电场的热效应对塔板高度的影响显示了出来，柱效开始下降，塔板高度非线性急剧上升。因此，进一步提高电压会使柱效降低。
图8 同一系统中，施加消滞留层电压后峰形宽度的变化。样品：CA4P。(徐小平提供)
Fig. In the same system, the change in peak shape width after theapplication of the residual layer voltage is applied. Sample: CA4P
上图是同一样品在色谱柱通电（黑线）与不通电（红线）谱图的比较。从图可见施加消滞留层的电压后峰形变狭窄。
图9 同一系统中，施加消滞留层电压后峰形宽度的变化。样品：CA4P。可见随着电压的升高，峰形由宽（黑色E=0V）变窄（深绿E=40V）. (徐小平提供)
Figure 9 shows the variation of the peak shape width after applying theresidual voltage of the residual layer in the same system. Sample: CA4P.
The peak shape change at different voltages. It can be seen that as thevoltage increases, the peak shape is narrowed by the width (black E=0V) (darkgreen E=40V).
5． 结论
填充柱色谱过程动力学研究了几十年，但研究工作者往往把色谱柱作为一维空间考虑，主要注意力在物质输运的纵向扩散对柱效率的影响，而没有认识到物质在柱内径向扩散对塔板高度的贡献。实际上在色谱过程中，物质的输运是在三维空间进行的。组分在柱内的输运过程中，不但会在纵向（z轴）扩散，而且会沿径向（x,y轴）扩散。径向扩散使得不同的分子有不同的行进路线，最终导致色谱峰形的扩张。
本文从热传导方程出发，在Horvath和Lin方程基础上，运用上世纪六十年代J.C.Giddings的方法推导了包含径向扩散因素及温度场在内的液相色谱塔板高度统一方程：
此方程概括了HPLC、UPLC、CEC、ESFLC色谱过程动力学中各种因素对塔板高度的影响。
从上述公式可见，色谱过程中发生的径向扩散和色谱柱的发热也是影响色谱分离效能的重要因素。液相色谱的H/u曲线并非过去认为的V型线而是U型线；过高的流动相线速度将导致柱效率崩溃；尤其是高流速情况下柱效与柱内径密切相关。发展高效、高速色谱技术除要减小担体粒径外必须缩小柱的内径。
注：本文在径向扩散系数的推导过程中没有限定流动相必须是液体。因此对于气相色谱依然成立。不同的是在GC过程中不考虑。此外，气体黏度值小。上式中也可不予考虑有
即填充柱色谱塔板高度方程应当在van Deemter 方程基础上加上径向扩散的贡献为：
（36）
毛细管气相色谱的Golay方程在推导过程中已经考虑了流动相流型对纵向扩散的影响。故不再赘述。
参考文献
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