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想利用HPLC测定植物根部脱落酸含量,目前没有一个准确的前处理步骤,我是想利用waters的固相萃取小柱进行前处理。下面是我初步的步骤,哪个大神给指导下,看看哪里不对或者需要注意什么?
dlleap
2019/08/05
私聊
液相色谱(LC)
想利用HPLC测定植物根部脱落酸含量,目前没有一个准确的前处理步骤,我是想利用waters的固相萃取小柱进行前处理。下面是我初步的步骤,哪个大神给指导下,看看哪里不对或者需要注意什么?
1.想利用HPLC测定植物根部脱落酸含量,目前没有一个准确的前处理步骤,我是想利用waters的固相萃取小柱进行前处理。下面是我初步的步骤,哪个大神给指导下,看看哪里不对或者需要注意什么?
SPE C18固相萃取小柱 6ml 500mg
1.活化
6ml色谱甲醇过柱,3-5ml/min。
2.平衡
6ml去离子水过柱,3-5ml/min,当水液面要比填料上表面高1mm左右,再上样。
3.上样
取上图第四步离心后的上清液过C18小柱,滴速为宜。过柱前上清液要利用1%乙酸调节pH至2.5-3.0之间。
4.淋洗
50%甲醇溶液,6ml淋洗过柱,去除杂质。抽干
5.洗脱
用2-4倍柱床体积的流动相洗脱。
2.下面是我的HPLC的步骤不知道对不对,希望有人做过类似的可以给指导下,万谢。
1g冷冻根样
↓
液氮研磨成粉末,加入8ml 80%甲醇,4℃浸提过夜,注意避光 第一步
↓
离心(10000rpm,4℃ 15min)→→→→→→→→→→→残渣
↓ ↓
↓ 甲醇悬浮,离心(10000rpm,4℃ 15min)第二,三步
↓ 合并 ↓
上清液←←←←←←←←←←←←←←←←←←←←← 上清液
↓
加PVPP0.3g(吸附色素,除去酚类物质,有机酸等) 第四步
离心(10000rpm,4℃ 15min)
↓
上清液过C18柱 第五步
↓
甲醇液
↓
N2吹干,加入1ml pH为3.0缓冲液溶解(此时,脱落酸成分子状态。可利用1%磷酸调节PBS的pH至3.0)
用乙酸乙酯等体积萃取3次(分液漏斗) 第六步
↓
取乙酸乙酯相(上层)N2吹干
1ml 初始流动相复溶(色谱甲醇:水=35:65(v/v)利用1%乙酸调节pH为3.0) 第七步
↓
0.45μm有机系微孔滤膜过滤 第八步
↓
HPLC测定样品
↓
测ABA
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