山楂饮片中三萜酸含量的测定
摘要
目的：测定市售山楂饮片中三萜酸和不同干燥方式处理后的山楂中三萜酸的含量。方法：通过实验研究测定不同炮制方式得到的市售山楂饮片中三萜酸的含量，比较数据后发现炒焦更有利于三萜酸的保留。实验通过设计五种不同干燥方式如晒干干燥、不同温度烘干、红外线干燥等对山楂干制过程中三萜酸含量的影响。结论：得到60℃烘干和晒干干燥是保证山楂中三萜酸含量最大值的理想的干燥方式，烘干干燥山楂时理想的干燥温度在60℃。
关键词：山楂饮片；干燥方法；三萜酸
Determinationof triterpenoid acids’content in Hawthorn
Abstract Objectives:Thispaper reviews the lastest progress ondetermining the contentof marketing triterpenoid acids of Hawthorn slices and different drying methodsefforted on the Hawthorn slices. Methods:The content of triterpenoid acids inthe marketing Hawthorn pieces was determined by experimental study. Aftercomparing the data,it was found that the scorch was more conductive to theretention of triterpenoid acids. The effect of five different drying methods,suchas natural drying,drying at different temperatures and drying with infrared ray,onthe content of triterpenoid acid in dried hawthorn was studied. Results:Dryingand drying at 60 ℃ are twoideal drying methods to guarantee the maximum value of the triterpenoid acid inhawthorn. When heated and dried hawthorn,the ideal drying temperature is 60℃.
Keywords: Hawthornslices;triterpenoid acid;drying method
1.前言
山楂为蔷薇科山楂属植物山里红或大果山楂及野山楂的干燥成熟果实。其果实作为常用中药，干制后可入药，是中国特有的药果兼用树种。近年来科学研究山楂的主要药理功能为具有降血脂、舒张血管降血压、强心等，同时具有抗心律失常等疗效。现代临床科学和动物实验研究证实山楂有降低血清总胆固醇（游离胆固醇和胆固醇酯）、甘油三酯（Triglyceride，缩写TRIG）。山楂三萜酸主要成分有3种，分别为山楂酸、齐墩果酸和熊果酸。齐墩果酸和熊果酸是互为同分异构体的两种五环三萜类化合物。齐墩果酸临床上用于护肝降酶，治疗支气管炎、肺炎、急性扁桃体炎、急性肠胃炎、泌尿系统感染，齐墩果酸还用于治疗急性肝炎 。熊果酸具有可以迅速降低体内谷丙转氨酶、血清转氨酶，在体内发挥消退黄疽、增加食欲和改善肝功能的作用，尤其在抗肿瘤，抗氧化，抗炎保肝，降血脂方面的作用疗效确切。
2 仪器与试药
2.1仪器
赛默飞3000高效液相制备色谱系统(含LPG-3400SD输液泵， VWD-3100紫外可见检测器，赛默飞变色龙色谱处理站)； 70-1 型红外线干燥箱，功率为 0.5 kW，由龙口市电炉制造厂生产；光明FW-80高速全能粉碎机（北京永光医疗器械有限公司）；HH-6数显恒温水浴箱；KQ-300VDE型三频数控超声波清洗器（昆山市, 江苏省镇淀山湖生产）；红外线干燥箱71-1型（龙口市仪器有限公司）。
2.2试药
山楂采收于山东省青州市王坟镇。色谱级甲醇（默克化学），分析级甲醇（天津富宇），其他试剂均为分析纯，蒸馏水为哇哈哈牌纯净水。山楂酸对照品（PRF7121942）购于成都普瑞法科技开发公司，齐墩果酸对照品（Q-003-110225）购于成都瑞芬思生物科技有限公司，熊果酸对照品（110742-200516）购于中国药品生物制品检定所。
3试验方法与结果
3.1供试品制备
取新鲜山楂，分为五组，干燥条件依次是晒干、40℃烘干、60℃烘干、80℃烘干、红外干燥。干燥后粉碎，经60目过筛，备用。
3.2色谱条件
Acclaim120-C18柱(250mm×4.6mm，5μl)色谱柱；流动相：甲醇：乙腈：醋酸铵水溶液 ( 12：67：21)；流速1ml /min；柱温 30℃；进样10μl；检测波长： 210nm。
3.3供试品溶液制备
精密称取1.0g山楂粉末于锥形瓶，加25mL甲醇，盖紧瓶塞称重；用超声波清洗器处理0.5h后，取出锥形瓶，冷却至室温，再次进行称重，用甲醇补足缺失的重量，摇匀，过滤。
3.4对照品溶液制备
精密称定对照品山楂酸、齐墩果酸和熊果酸适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解后加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品浓度为：山楂酸0.0482mg/mL、齐墩果酸0.1756mg/mL、熊果酸0.1576mg/mL。
3.5方法学考察
3.5.1标准曲线的绘制
分别精密量取齐墩果酸与熊果酸标准溶液0.5，1.0，3.0，5.0，8.0，10.0，15.0mL （对照品浓度为：山楂酸0.0482mg/mL、齐墩果酸0.1756mg/mL、熊果酸0.1576mg/mL）进样5μL测定，以峰面积Y对进样量X进行线性回归。标准曲线见图1、2、3。
图1 山楂酸标准曲线图
图2 齐墩果酸标准曲线图
图3熊果酸标准曲线图
得山楂酸、齐墩果酸和熊果酸回归曲线分别在0.5~15.0μL范围呈线性，结果见表1。
表1三萜酸标准曲线
3.5.2精密度试验
精密称取山楂粉末1.0g，按照“3.2供试品溶液制备”方法制备供试品溶液，依次在高效液相色谱仪自动进样，重复进样5次。测定峰面积，求得山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的RSD值。考查结果见表2。
表2 精密度试验结果
相对标准偏差（RSD）反映本实验分析测试结果的精密度，由表2数据可知山楂酸、齐墩果酸熊果酸的RSD均小于3%，表明测量数据比较集中，表明仪器的精密度良好。
3.5.3重复性试验
精密称取山楂粉末5份各1.0g，按照“3.2供试品溶液制备”方法制备供试品溶液，连续进样。测定峰面积，计算3种三萜酸含量，得山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的RSD值。考查结果见表3。
表3 重复性试验结果
表3数据表明，测得平均含量的山楂酸为0.0172%，齐墩果酸为0.0831%，熊果酸为0.4574%，3种三萜酸重复性试验的RSD分别为1.54%、1.42%、2.72%，均小于3%表明实验的重复性良好。
3.5.4稳定性试验
取供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24h进样，测定峰面积，计算山楂酸、齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD值，结果见表4。
表4 稳定性试验结果
表4数据表明，山楂酸的RSD为1.65%，齐墩果酸RSD为1.62%，熊果酸RSD为2.73%。表明供试液在24h内稳定。
3.5.5加样回收试验
取已知含量的山楂粉末0.5g，精密称定，加入与之含量相当的对照品，按照“3.2供试品溶液制备”方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的平均回收率和RSD。考查结果见表5、6、7。
表5山楂酸回收试验结果
表6齐墩果酸回收试验结果
表7熊果酸回收试验结果
由5、6、7可知，山楂酸平均回收率为102.1%，RSD为2.35%，齐墩果酸平均回收率为99.1%，RSD为2.32%，熊果酸平均回收率为100.5%，RSD为1.82%，表明方法准确度良好。
3.6样品测定
照“3.2”项下色谱条件测定市售山楂样品中山楂酸、齐墩果酸、熊果酸的含量。结果见表8、9、10。
表8 24批生山楂中三萜酸含量
表9 3批炒山楂中三萜酸含量
表10 8批焦山楂中三萜酸含量
表8数据表明，生山楂中山楂酸的含量在0.007%~0.025%，平均含量为0.014%；齐墩果酸的含量在0.067%~0.127%，平均含量为0.084%。熊果酸的含量在0.302%~0.615%，平均含量为0.416%。
表9数据表明，炒山楂中山楂酸的含量在0.010%~0.016%，平均含量为0.012%。齐墩果酸的含量在0.065%~0.073%，平均含量在0.071%；熊果酸的含量在0.318%~0.365%，平均含量在0.348%。
表10数据表明，焦山楂中山楂酸的含量在0.011%~0.029%，平均含量为0.021%；齐墩果酸的含量在0.071%~0.098%，平均含量在0.086%；熊果酸的含量在0.346%~0.464%，平均含量为0.415%。
表11不同干燥方式对山楂饮片中三萜酸含量的影响
4 讨论与小结
实验比较了甲醇-磷酸水系统、乙腈-磷酸水系统、乙腈-醋酸铵水系统等，最终确定采用甲醇-乙腈-醋酸铵水系统为流动相，采用梯度洗脱测定3种三萜酸的含量。
图5 3种三萜酸结构式
山楂中3种三萜酸的保留时间不同是由于3种三萜酸的极性存在差异，山楂酸结构中比齐墩果酸和熊果酸多一个羟基，极性大所以保留时间短；而齐墩果酸和熊果酸结构类似，齐墩果酸和熊果酸吸光度和质量相差不大，极性相当，分离较为困难。
图6 山楂样品三萜酸高效液相色谱图
由表8~10可知，山楂酸、齐墩果酸、熊果酸3种三萜酸含量均呈现焦山楂＞生山楂＞炒山楂的趋势，其原因可能有①炒制时加热过程会对其成分产生一定的影响；②炒山楂、焦山楂样本量过少，使测定数据不准确；③一般炒山楂、焦山楂等炮制品均不采用质量较好的山楂，对测定结果有影响。在进一步的试验中，一方面扩大市售炒山楂、焦山楂的样本量，使其能更准确的代表市售饮片的质量情况；另一方面将自制若干批炒山楂和焦山楂，进行3种三萜酸的含量测定，考察炮制时的加热过程度化学成分的影响。
表11数据表明，不同的干燥方式制成的山楂片中三萜酸的含量存在一定差异。而晒干干燥法制备的山楂饮片（0.552%）略高于40℃烘干（0.539%）而低于80℃烘干（0.561%），晒干是最省能源最环保的干燥方式，但受到天气影响较大，不适于饮片厂大规模生产加工，且晒干干燥所得山楂饮片断面略黄，外观稍差。60℃烘干干燥法制备的山楂饮片3种三萜酸总含量最高（0.588%），高于含量最低的红外干燥法制备的山楂饮片（0.475%）24%，表明60℃烘干法为最佳干燥方式。本实验只进行了一批山楂干燥方式的实验，尚需多批次实验以验证实验结果。
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