一种银黄颗粒HPLC指纹图谱的检测方法及其应用
摘要目的：本研究介绍了银黄颗粒及其原料药黄芩和金银花的指纹图谱的建立方法，包括供试品溶液的制备、高效液相色谱仪测定及对数据和图谱的处理，以及由该方法制备得到的相应指纹图谱。方法：使用Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）+ Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，3 μm）色谱柱在紫外235 nm吸收波长，选用流动相：乙腈(A)-0.3%磷酸(B)梯度洗脱，0~103 min，17%ACN; 103~142 min，17%→27%ACN；142~156 min，27%→29%ACN；156~179 min，29%→41%ACN；179~219min，41%→80%CAN。结果：在测定的不同厂家 10 批次样品的色谱图中，选择90%以上批次样品均有的色谱峰为共有峰，银黄颗粒。黄芩药材、金银花药材分别确定了22，22，21 个共有峰。结论：为银黄颗粒定性鉴别提供借鉴。
关键词：银黄颗粒；黄芩；金银花；指纹图谱
A Method for Detecting Fingerprint of Yinhuang Granules by HPLC and ItsApplication
Abstract Objective: To introduce the method ofestablishing fingerprint of Yinhuang granules and its raw materials,Scutellaria baicalensis and Lonicera japonica, including the preparation ofsample solution, determination by high performance liquid chromatography andthe treatment of data and chromatogram, as well as the correspondingfingerprint obtained by this method. METHODS: Venusil MP C18 (4.6 mm×250 mm, 5 mm) + Venusil MP C18 (4.6 mm×250mm, 3 mm) column was used at 235 nmultraviolet absorption wavelength. The mobile phase was selected: acetonitrile(A) - 0.3% phosphoric acid (B) gradient elution, 0-103 min, 17% ACN, 103-142min, 17% to 27% ACN, 142-156 min, 27% to 29% ACN, 156-179 min, 29% to 4% ACN.1% ACN; 179 ~ 219 min, 41%80% CAN. RESULTS: In the chromatograms of 10 batchesof samples from different manufacturers, more than 90% of the samples hadcommon peaks, Yinhuang granules. Scutellaria baicalensis and Lonicera japonicahave 22, 22 and 21 peaks respectively. CONCLUSION: It can provide reference forthe qualitative identification of Yinhuang Granules.
Key words: Yinhuang granules;Scutellaria baicalensis; Honeysuckle; Fingerprint
一、前言
银黄颗粒组方由金银花和黄芩构成，具有清热疏风、利咽解毒的功效，用于外感风热、肺胃热盛所致的咽干、咽痛、喉核肿大、口渴、发热急慢性扁桃体炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染等症。该复方原料金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，主产于山东、河南和河北等地。该复方原料黄芩为唇形科黄芩属多年生草本植物，产于河北，河南，陕西，山西，山东等地。黄芩提取物的主要活性成分为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素，金银花提取物是从金银花中提取的有机酸类活性成分。该制剂及其原料药成分复杂，生产厂家及产地众多，样品存在差异。中药 HPLC 指纹图谱技术被认为是当前能较全面反映中药材及复方整体化学成分信息的方法，能更有效地评价中药的质量信息。本研究在分析上述研究背景的基础上，收集来源于不同产地的各50批金银花和黄芩药材，并制成银黄颗粒成品，再采用HPLC法同时建立金银花药材，黄芩药材和相应批次银黄颗粒的指纹图谱，选出各自的共有峰，从而确定不同产地，不同厂家的的药材共有物质及其数量。
二、材料与方法
1仪器与试剂、试药
1.1仪器
Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），Waters 2998紫外检测器（美国Waters公司），Waters Empower色谱工作站（美国Waters公司）；AGBP210S电子天平（Sartorius公司）；MILLIPORE纯水机（MILLIPORE公司）；高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司，FW-80型）；SB4200DTS超声波双频清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；KDM-A控温电热套（金坛市医疗仪器厂）；Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）和Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，3 μm）。
1.2 试剂与试药
乙腈（上海星可高纯溶剂有限公司，色谱纯）；甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
对照品来源：葛根素（批号:110752-200912）购自中国食品药品检定研究院。
2方法
2.1 HPLC色谱条件的考察
2.1.1不同流动相的考察
比较了乙腈--0.05%甲酸、乙腈-0.4%甲酸、乙腈-0.3%甲酸的流动相系统进行洗脱。见图1。
乙腈--0.05%甲酸
乙腈-0.4%甲酸
乙腈-0.3%甲酸
图1 不同流动相系统下银黄颗粒指纹图谱
结果表明，前二者分离度均相对较差，且乙腈-0.05%甲酸均基线噪音大。最终选用乙腈-0.3%磷酸作为流动相系统，所得色谱峰型较好，基线平稳，分离效果最佳。
2.1.2 梯度洗脱条件的选择
本实验考察了不同比例的乙腈-磷酸的洗脱条件，尽可能多且全面展现银黄颗粒样品的峰信息，考察了以下4个洗脱程序。
梯度条件一：流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)梯度洗脱，0~70 min，17%ACN；70~100 min，17%→20% ACN；100~110 min，20%→25% ACN；110~140 min，25%→55% ACN；140~150 min，55%→70%ACN。
梯度条件二：流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)梯度洗脱，0~80min，17%ACN；80~139min，17% →34% ACN；139~159 min，34% →64% ACN；159~170min，64% →80% ACN。
梯度条件三：流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)梯度洗脱，0~103min，17%ACN；103~142min，17%→24%ACN；142~165min，24%→33%ACN；165~195 min，33%ACN；195~280min，33%→70%ACN。
梯度条件四：流动相：乙腈(A)-0.3%磷酸(B)梯度洗脱，0~103 min，17%ACN; 103~142min，17%→27%ACN；142~156 min，27%→29%ACN；156~179 min，29%→41%ACN；179~219min，41%→80%CAN。结果梯度条件四下的指纹图谱，色谱图中采集的色谱峰形好，峰数多且分离度良好，基线较平稳，能展现最多的谱图信息，故确定为最终梯度条件，见图2。
梯度条件一
梯度条件二
梯度条件三
梯度条件四
图2 不同洗脱条件下银黄颗粒指纹图谱
2.1.3 不同流速的选择
分别考察同一样品供试液，以梯度条件四下的方法，测定其流速在0.9 mL·min-1、 0.8 mL·min-1、 0.7mL·min-1时的分离效果。
结果表明，流速在0.9 mL·min-1和0.8mL·min-1时，130min附近两峰分离效果不理想，而0.7 mL·min-1时峰形及分离情况均比较理想。综合考虑，选择0.7 mL·min-1流速。见图3。
流速：0.9 mL·min-1
流速：0.8 mL·min-1
流速：0.7 mL·min-1
图3 不同流速下银黄颗粒指纹图谱
2.1.4 测定波长的选择
对同一银黄颗粒样品供试液在235～295 nm波长范围内，每隔20 nm测定一次，选择最佳吸收波长。其色谱图结果见图4。
235 nm
255 nm
275 nm
295 nm
图4 不同波长下银黄颗粒指纹图谱
由图4结果可知，在235 nm时，色谱图中峰形佳，各峰间比例协调，基线较平稳，且呈现的峰信息量大。因此，选用235 nm作为测定波长。
2.2 不同色谱柱的考察
考虑到银黄颗粒中主要是黄酮类成分，故选用C18柱，对色谱柱进行考察，分别使用VenusilMP C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，3 μm），Agela MP S/N.三根色谱柱及其不同组合，在同一梯度条件下分别对同一银黄颗粒供试液进行指纹图谱峰的采集，结果前四根色谱柱分离度相对较差，Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）+ Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，3 μm）组合柱分离出的色谱峰较多，峰型较好，对流动相条件进行微调后，进行色谱图的采集。见图5。
Agela MP S/N（4.6 mm × 250 mm，3 μm）
Agela MP S/N（4.6 mm × 250 mm，3 μm）
Venusil MP C18（4.6 mm× 250 mm，3 μm）
Agela MP S/N（4.6 mm × 250 mm，3 μm）+Venusil MP C18（4.6 mm× 250 mm,5 μm）
Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）+ Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，3 μm）
图5 不同色谱柱银黄颗粒指纹图谱
2.3 方法学考察
2.3.1 仪器精密度考察
取银黄颗粒同一样品供试液，10 μL进样，连续进样 5次，按“4.1”项下的色谱条件进样测定，以葛根素为参照峰，计算共有峰的峰面积和相对保留时间比值。结果显示各共有峰的相对峰面积RSD＜3 %，相对保留时间RSD＜3%，表明仪器精密度良好。见表1、2。
表1 银黄颗粒指纹图谱精密度（相对峰面积）
表2 银黄颗粒指纹图谱精密度（相对保留时间）
2.3.2 重复性试验
2.3.2.1银黄颗粒重复性实验考察
银黄颗粒研细后精密称取细粉1.0 g，称取五份分别置于100 ml 的圆底烧瓶中，精密加入煮沸的蒸馏水100 ml于圆底烧瓶中，称重，加热回流30 min，回流后放冷，补重，过滤，取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀，作为供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照既定方法采集色谱指纹图谱，计算相对峰面积值和相对保留时间值，结果见表3、4的25个峰的RSD值都接近3%，由此可以得出结论，银黄颗粒的重复性良好。
表3 银黄颗粒指纹图谱重复性（相对峰面积）
表4 银黄颗粒指纹图谱重复性（相对保留时间）
2.3.2.2黄芩药材重复性实验考察
黄芩药材研细后精密称取细粉0.57 g，称取五份分别置于100 ml 的圆底烧瓶中，精密加入煮沸的蒸馏水50 ml于圆底烧瓶中，称重，加热回流40 min，回流后放冷，补重，过滤，取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀，作为供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照既定方法采集色谱指纹图谱，计算相对峰面积值和相对保留时间值，结果见表5、6的15个峰的RSD值都接近3 %，由此可以得出结论，黄芩药材的重复性良好。
表5黄芩药材指纹图谱重复性（相对峰面积）
表6 黄芩药材指纹图谱重复性（相对保留时间）
2.3.2.3金银花药材重复性实验考察
金银花药材研细后精密称取细粉0.5 g，称取五份分别置于100 ml 的圆底烧瓶中，精密加入煮沸的蒸馏水100 ml于圆底烧瓶中，称重，加热回流30 min，回流后放冷，补重，过滤，取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀，作为供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照既定方法采集色谱指纹图谱，计算相对峰面积值和相对保留时间值，结果见表7、8的15个峰的RSD值都接近3%，由此可以得出结论，金银花药材的重复性良好。
表7 金银花药材指纹图谱重复性（相对峰面积）
表8 金银花药材指纹图谱重复性（相对保留时间）
2.4.3 稳定性试验
2.4.3.1银黄颗粒稳定性实验考察
银黄颗粒研细后精密称取细粉1.0 g置于100 ml 的圆底烧瓶中，精密加入煮沸的蒸馏水100 ml于圆底烧瓶中，称重，加热回流30 min，回流后放冷，补重，过滤，取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀，作为供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照既定方法采集色谱指纹图谱，计算相对峰面积值和相对保留时间值，结果见表9、10的25个峰的RSD值都接近3 %，由此可以得出结论，银黄颗粒的稳定性良好。
表9 银黄颗粒指纹图谱稳定性（相对峰面积）
表10 银黄颗粒指纹图谱稳定性（相对保留时间）
2.4.3.2黄芩药材稳定性实验考察
黄芩药材研细后精密称取细粉0.57 g置于50 ml 的圆底烧瓶中，精密加入煮沸的蒸馏水100 ml于圆底烧瓶中，称重，加热回流40 min，回流后放冷，补重，过滤，取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀，作为供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照既定方法采集色谱指纹图谱，计算相对峰面积值和相对保留时间值，结果见表11、12的25个峰的RSD值都接近3 %，由此可以得出结论，黄芩药材的稳定性良好。
表11 黄芩药材指纹图谱稳定性（相对峰面积）
表12 黄芩药材指纹图谱稳定性（相对保留时间）
2.4.3.3金银花药材稳定性实验考察
金银花药材研细后精密称取细粉1.0 g置于100 ml 的圆底烧瓶中，精密加入煮沸的蒸馏水100 ml于圆底烧瓶中，称重，加热回流30 min，回流后放冷，补重，过滤，取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀，作为供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照既定方法采集色谱指纹图谱，计算相对峰面积值和相对保留时间值，结果见表13、表14，25个峰的RSD值都接近3 %，由此可以得出结论，金银花药材的稳定性良好。
表13 金银花药材指纹图谱稳定性（相对峰面积）
表14 金银花药材指纹图谱稳定性（相对保留时间）
2.5 样品共有峰的确定
对10 批不同厂家的银黄颗粒及黄芩和金银花药材供试液进行分析，采集指纹图谱，并以葛根素作为参考峰，银黄颗粒选取标定了22个共有峰，见图6。黄芩药材选取标定了22个共有峰，见图7。金银花药材选取标定了21个共有峰，见图8。
图6 10 批次的银黄颗粒共有特征峰
图7 10 批次的黄芩共有特征峰
图8 10 批次金银花药材的共有特征峰
三、结果与分析
本研究介绍了银黄颗粒及其原料药黄芩和金银花的指纹图谱的建立方法，包括供试品溶液的制备、高效液相色谱仪测定及对数据和图谱的处理，以及由该方法制备得到的相应指纹图谱。在测定的不同厂家 10 批次样品的色谱图中，选择90 %以上批次样品均有的色谱峰为共有峰，银黄颗粒。黄芩药材、金银花药材分别确定了22，22，21 个共有峰。
四、讨论与结论
本研究的指纹图谱构建方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大，采用指纹图谱找出不同产地，不同厂家的同一药材的共有峰为质量控制手段，既避免了因只测定一、两个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，通过对多个批次的样品进行系统分析，能更加全面、科学评价银黄颗粒的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。
参考文献
王亚丹，杨建波，戴忠，等.中药金银花的研究进展.药物分析杂志，2014，34( 11):1928-1935
中国药典.一部.2015:1498
王彩芳，张楠，黄龙，等. HPLC法测定不同厂家银黄颗粒中黄芩苷的含量.医药论坛杂志，2006，27 (24):27-28
王彩芳，黄龙，程茜，等.高效液相色谱法测定不同厂家银黄颗粒中绿原酸的含量.时珍国医国药，2007，18(5):1143-1144
黄雄，黄嬛，王峻，等.银黄颗粒的HPLC特征图谱分析.药物分析杂志，2009，29(8):1320-1323
肖小河，王永炎.从热力学角度审视和研究中医药.国际生物信息与中医药论丛.新加坡:新加坡医药卫生出版社，2004:74
贺福元，罗杰英，刘文龙，等.中药谱效学研究方向方法初探.世界科学技术-中医药现代化，2004，6(6):44-50
赵渤年，于宗渊，丁晓彦，等.黄芩质量评价谱-效相关模式的研究.中草药，2011.42(2):380-383
高燕，赵渤年，于宗渊等.金银花抗流感病毒毒谱-效相关质量评价模式的研究.中华中医药杂志，2013.28(12):3508-3511
Ke Li， Wei Cheng， Xiao-Jian Liu，hu-Bin Li， En-Guang Hou， Yan Gao， Liang Wang， Qing Liu， Bo-Nian Zhao， Zong-Yuan Yu， Mathematical Modelling for the Quality Evaluation of Baikal Skullcap Root， Applied Mechanics and Materials， 2011
王荣梅，徐丽华，林永强.HPLC法同时测定银黄含片中6个咖啡酰奎宁酸类成分的含量.药物分析杂志，2012，32(1):57-60
高苏亚，范涛，王黎等.红外光谱技术结合化学计量学方法在中药研究中的应用.应用化工，2012，41(2):324-328
王鹏，王振国，薛付忠等.基于支持向量机法的中药性状与药性相关性研究. 江西中医药，2012，43(355):65-68
Cifford MN， Johnston KL， Knight S et al. Hierarchical scheme for LC-MS identification of chlorogenic acids.J Agric Food Chem，2003;51(10):2900-2910
张倩，张加余，隋丞琳，等. HPLC-DAD-ESI-MS/MS研究金银花水提工艺中绿原酸类成分的变化规律.中国中药杂志，2012;37(23):3564-3567
沈红，段金廒，钱大玮，等.黄芩及复方野马追胶囊中黄酮类成分的LC-MS/MS分析.药物分析杂志，2009;29(9):1425-1429
赵胜男，李守拙.黄芩药材中黄酮类成分的HPLC-MS研究.承德医学院学报2012;29(4):345-347
Chkoshi E， Nagashima T， Sato H， et al. Simple preparation of baicalin from Scutellariae Rdixi. J Chromatogr A，2009; 1216(11): 2192 -2194
高燕，吕凌，王亮，等.银黄颗粒HPLC指纹图谱与模式识别分析.中华中医药杂志，2017，32(09):4238-4242
丁晓彦，刘青，李岩，等.丹参脂溶性成分的HPLC指纹图谱及模式识别研究.中华中医药杂志，2016，3(6):2254-2256
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