仪器信息网APP

选仪器、听讲座、看资讯

立即体验

当前位置：仪器社区 >质谱 > 液质联用（LCMS） > 帖子详情

SPE-UPLC-MS/MS测定葡萄酒中的高氯酸盐

hhciq

2019/09/12
光谱滴定研发

私聊

液质联用（LCMS）

SPE-UPLC-MS/MS测定葡萄酒中的高氯酸盐

摘要：为建立前处理简单、定量准确、高灵敏度的测定葡萄酒中高氯酸盐的快速分析方法，本研究使用酸化甲醇水提取葡萄酒样品，WAX固相萃取柱前处理净化，亲水性聚丙烯滤膜（GHP）过滤，经Phenyl-hexyl色谱柱分离，以电喷雾离子源（ESI）在多反应监测（MRM）负离子模式下进行测定。最终得到方法的检测时间为12min，检出限和定量限分别为0.15μg·L^-1和0.5 μg·L^-1，在1 μg·L^-1、2 μg·L^-1、5 μg·L^-1、10 μg·L^-1、20 μg·L^-1的加标水平回收率在94.5%到105%之间，相对标准偏差（RSD）小于3.17%。该方法的建立可以为葡萄酒生产企业和相关安全执法部门的检测提供技术支持。
关键词：超高效液相色谱-串联二级质谱（UPLC-MS/MS）；高氯酸盐；葡萄酒

Determination of perchlorate in wine bySPE-UPLC-MS/MS

Abstract: In order to establish a rapidanalysis method for perchlorate in wines with simple pretreatment, accuratequantitative and high sensitivity, wine samples were extracted with acidifiedmethanol water, purified by WAX solid phase extraction column, filtered byhydrophilic polypropylene membrane (GHP). Separated by Phenyl-hexyl column anddetermined by electrospray ionization (ESI) in multiple reaction monitoring(MRM) negative ion mode. The final detection time was 12 min, and the detectionand quantification limits were 0.15 μg·L^-1 and 0.5 μg·L^-1,respectively, at 1 μg·L^-1, 2 μg·L^-1, 5 μg·L^-1.The recoveries in the spiked levels of 10 μg·L^-1 and 20 μg·L^-1ranged from 94.5% to 105% with a relative standard deviation (RSD) of less than3.17%. The establishment of this method can provide technical support for thetesting of wine producers and relevant security law enforcement agencies.
Keywords：Ultra performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry; perchlorate; wine

高氯酸盐是一种无机环境污染物，能通过动物乳腺中的I^-通道污染乳汁，导致发育中的婴儿先天性甲状腺机能不足，影响其神经中枢的正常生长发育，这是由于ClO₄^-和I^-结构类似，可以竞争性抑制甲状腺对I^-的吸收，进而影响甲状腺正常功能。高氯酸盐污染的主要来源包括军事、航天及烟花爆竹，常作为氧化剂被广泛应用于军工制造和工业生产，干旱地区的高温强蒸发特性会使高氯酸盐更容易沉积富集，其土壤中检出浓度远高于潮湿地区，因此易富集在干旱地区的葡萄果实中进而影响葡萄酒安全，所以环境中的高氯酸盐会对葡萄酒安全产生威胁，有必要对其进行监测。许多国家对高氯酸盐每日的摄入量进行了限制，2008年美国毒物与疾病登记署对高氯酸盐的限量规定为0.7 μg·kg^-1，2009年美国环保署（US EPA）建议将饮用水中的高氯酸盐浓度标准定为15 μg·L^-1，2014年欧盟食品安全局根据实验，制定了高氯酸盐的每日耐受摄入量为0.3 μg·kg^-1。

目前国内外测定高氯酸盐含量方法包括分光光度法、离子色谱-质谱法、高效液相色谱-质谱法等，其中针对水、土壤等基质的测定方法研究较多，对葡萄酒的测定方法研究较少，Houssain E A等利用离子色谱串联二级质谱技术首次采用分析方法测定葡萄酒中高氯酸盐含量，李柚等人利用离子色谱技术建立了测定红葡萄酒中高氯酸盐的分析方法，但该方法灵敏度低，很难满足进出口食品中的限量要求，且离子色谱法多适用于基质简单的样品，对于基质复杂的样品，易受基质干扰而无法实现准确检测。我国SN / T 4089—2015《进出口食品中高氯酸盐的测定液相色谱-质谱/质谱法》建立了高氯酸盐测定的液相色谱-串联质谱法，但该标准适用范围未包含葡萄酒，且此方法易对质谱仪造成污染。姚清华等在测定茶叶中高氯酸盐的研究中使用固相萃取技术（Solid Phase Extraction，SPE）去除了提取液中的茶叶色素和大分子类干扰物质，杨志伟等同样使用固相萃取技术对蜂蜜样品进行前处理，有效减少了样品对仪器的污染。

本试验参考葡萄酒中高氯酸盐含量测定方法的相关研究和定量要求，结合当前国内外对高氯酸盐对食品污染的研究进展，根据葡萄酒特点和高氯酸根离子的性质，使用亲水性聚丙烯滤膜（GHP）和WAX固相萃取柱对葡萄酒样品进行除杂并消除基质影响，再结合使用超高效液相色谱-串联二级质谱（UPLC-MS/MS）技术进行检测，最终得到灵敏度高、前处理简便、检测时间短、重复性好的检测方法。该方法灵敏度满足进出口葡萄酒中高氯酸盐的测定要求，可以为葡萄酒生产企业和相关安全执法部门提供技术支持。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
21种干红葡萄酒、干白葡萄酒，购买于秦皇岛海港区广源超市；本研究中所有试剂均为色谱级或更好，高氯酸钠标准品（NaClO₄，98%）、高氯酸盐¹⁸O标准品（NaCl¹⁸O₄，97%）购买于美国Sigma 公司；甲酸、甲醇购买于中国迪马科技公司；所用水均为从超纯水系统获得的超纯水。
1.2 仪器与设备
Nexera 30A超高效液相色谱仪，日本岛津公司；Qtrip 6500三重四极杆质谱仪，美国AppliedBiosystems公司；涡旋混匀器，美国Scientific Industries公司；Million-QIQ7000超纯水系统，德国Millipore公司；C18色谱柱（150 mm ×2.1 mm，3 μm）、Phenyl-Hexyl色谱柱（150 mm ×2.1 mm，3 μm）、C18固相萃取柱（500 mg / 3mL）、WAX固相萃取柱（60 mg / 3mL）、亲水性聚丙烯滤膜（GHP，0.20 μm）、尼龙66滤膜（0.22 μm）、聚醚砜滤膜（0.22 μm），美国Waters公司。
1.3 试验方法
1.3.1 溶液配制
用水NaClO₄标准品，配制成1mg·mL^-1的高氯酸钠储备液，4 ℃条件下保存；用水溶解NaCl¹⁸O₄标准品，配制成0.5 mg·mL^-1内标标准储备液，4 ℃条件下保存；根据需要用水逐级稀释标准储备液，配制成适当浓度的标准工作溶液。用含0.1%甲酸的甲醇水配制定容液，甲醇水体积比为10: 9；将150 mL乙醇和3 g酒石酸移入1 L的容量瓶中，去离子水定容，得到模拟酒样。
1.3.2 样品预处理
取5 mL酒样至25 mL聚乙烯离心管中，加入50 μL内标工作溶液涡旋混合2-3 min，待净化。取待净化酒样过WAX固相萃取柱净化，先用6 mL甲醇和6 mL水活化固相萃取柱，再依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗，抽干，6 mL 10%氨水甲醇洗脱，使用氮气吹干后用1 mL定溶液复溶，经GHP滤膜过滤后进样。
1.3.3 仪器条件
色谱条件：色谱柱：Phenyl-hexyl色谱柱（150 mm ×2.1 mm, 3.5 μm）；进样量：5 μL；柱温：30 ℃；流动相A：5%甲醇溶液(含1%甲酸)；流动相B：1%甲酸甲醇溶液，流速：0.2 mL·min^-1；洗脱程序：0—2 min 50%B，2—8 min 80% B，8—10 min 50% B，10—12 min40% B；阀切换：3 min B，8.5 min A。
质谱条件：离子源：EI离子源；电离方式：ESI^-模式；检测方式：MRM；电喷雾电压：4000 V；雾化气压力：0.5 MPa；气帘气压力：0.35 MPa；辅助气压力：0.7 MPa；辅助气温度：550 ℃；碰撞室出口电压：13 V；定性离子对、定量离子对、保留时间、去簇电压和碰撞能量见表1。
表1 质谱参数

Table.1 Parametersof mass spectra of Perchlorate

名称 Name	监测离子对Monitoring ion pair/m·z^-1	定量离子对 Quantitative ion pair/m·z^-1	保留时间Keep time/min	去簇电压 De-clustered voltage（DP）/V	碰撞气能量Collision gas energy（CE）/eV
高氯酸钠 NaClO₄	98.8/82.8	98.8/82.8	4.99	-45	-36
高氯酸钠 NaClO₄	100.8/84.8	98.8/82.8	4.99	-45	-36
高氯酸钠NaCl¹⁸O₄	106.9/88.8	106.9/88.8	4.98	-45	-37
高氯酸钠NaCl¹⁸O₄	106.9/70.9	106.9/88.8	4.98	-45	-56

2 结果与分析
2.1 质谱条件的优化
已知自然界中氯元素存在³⁵Cl与³⁷Cl这2种同位素状态，使得NaClO₄在质谱中出现两种质量数不同的质谱图，在1.3.3条件下高氯酸钠及其内标物质的母离子和MS2质谱图见图1—3。其母离子峰见图1，图1中质荷比为98.8的离子片段为Na³⁵ClO₄，100.8的离子片段为Na³⁷ClO₄，再分别优化相应质谱参数，得到MS2图，见图2、图3。

图1 母离子质谱图

Fig.1 Protonion mass spectrum

a. NaClO₄ b. NaCl¹⁸O₄

图2 高氯酸盐的MS2质谱图

Fig.2Secondary mass spectrum of perchlorate

a. Na³⁵ClO₄ b. Na³⁷ClO₄

图3 内标的MS2质谱图

Fig.3Secondary mass spectrum of internal standard

2.2 色谱条件的选择
为得到效果更好的色谱图，本试验对C18色谱柱和Phenyl-hexyl色谱柱的保留效果进行比对，发现高氯酸盐在C18色谱柱上无法的到有效的色谱峰，在Phenyl-hexyl色谱柱上具有更好的保留效果，推测这是由于高氯酸根离子带有负电荷，而C18色谱柱填充物为非极性物质导致，Phenyl-hexyl色谱柱对酸性、碱性和中性化合物均有较好的分离度和重现性，因此本实验最终选择Phenyl-hexyl色谱柱，色谱图见图4—5。

图4 过Phenyl-hexyl色谱柱的样品色谱图

Fig.4 Sample chromatogram of Phenyl-hexyl column

a. Na³⁵ClO₄b. Na³⁷ClO₄

图5 过C18色谱柱的样品色谱图

Fig.5 Sample chromatogram of C18 column

2.3 滤膜的选择
由于不同材质的滤膜对高氯酸盐吸附程度存在差异，本试验对3种滤膜的吸附效果和未过膜比较，发现ClO₄^-在尼龙膜上有很强吸附，通过率仅为0.9%，聚醚砜滤膜的通过率为90%，亲水GHP（亲水性聚丙烯）滤膜的通过率为98%，同时GHP滤膜具有无毒性、耐化学性能优良、强度好等优点，因此确定使用GHP滤膜，不同滤膜对高氯酸盐的吸附情况见图6。

图6 3种不同材质滤膜对高氯酸盐的通过率

Fig.6 Pass rate of perchlorate by threedifferent filter membranes

2.4 前处理方式的选择
为尽可能消除样品中干扰物影响，将基体和干扰化合物分离。本试验选择C18固相萃取柱、WAX固相萃取柱进行样品前处理和未过柱进样比较，不同前处理方式的样品色谱图见图7。
如图7所示，未过柱样品色谱图峰型较宽，基线高，受基质影响大；过C18固相萃取柱与未过柱相比，基质影响小，但无明显差别；过WAX固相萃取柱的样液色谱图基线低，峰型好，基质影响小，且与其它方法相比，WAX固相萃取柱在分离干扰物时可对目标化合物进行富集，增强对待测物的检出能力，这是由于WAX柱的填料为混合型弱阴离子交换吸附剂，对含强酸基团的化合物具有高选择性和灵敏度，因此选择WAX固相萃取柱作为前处理的固相萃取柱。

图7 不同优化条件下的样品色谱图

Fig. 7 Sample chromatogram under differentoptimized conditions

a.WAX SPEcolumn b. C18 SPE column c. None

2.5 方法学验证
在上述优化条件下，使用空白基质液配制浓度为1、2、5、10、20 μg·L^-1，内标浓度为2.5 μg·L^-1的标准工作液平行10次试验，根据5个浓度梯度的空白样品基线噪音值求平均值，根据3倍信噪比计算方法检出限，10倍信噪比计算方法定量限，最终得到方法回收率为94.5%～105%，相对标准偏差为0.94%～3.17%，结果见表2-3。

表2 方法学验证

Table.2 Methodological Validation

名称

Name

回归方程

Regression equation

R²

线性范围

Linear range/μg·L^-1

检出限

The detection limit/μg·L^-1

定量限

The limit of quantitation/μg·L^-1

高氯酸钠

NaClO₄

Y = 0.283 X + 0.097

0.9998

0.5 ~ 500

0.15

0.5

表3 葡萄酒中高氯酸盐加标回收率及RSD(n=10)

Table.3 Scaling recovery and RSD of Perchlorate in wine

序号 Serial number	添加水平 Add level
	1 μg·L^-1		2 μg·L^-1		5 μg·L^-1		10 μg·L^-1		20 μg·L^-1
	测定值measured value	回收率Recovery rate/%	测定值measured value	回收率Recovery rate/%	测定值measured value	回收率Recovery rate/%	测定值measured value	回收率Recovery rate/%	测定值measured value	回收率Recovery rate/ %
1	0.945	94.5	1.920	96	5.000	100	9.720	97.2	19.400	97
2	1.000	100	1.930	96.5	4.810	96.2	9.610	96.1	19.700	98.5
3	0.952	95.2	1.950	97.5	5.000	100	9.540	95.4	19.600	98
4	1.050	105	2.000	100	4.840	96.8	9.960	99.6	19.200	96
5	0.968	96.8	2.030	101.5	4.950	99	9.860	98.6	19.500	97.5
6	0.997	99.7	1.950	97.5	4.940	98.8	9.960	99.6	19.400	97
7	0.976	97.6	2.000	100	4.980	99.6	9.900	99	19.800	99
8	0.979	97.9	1.950	97.5	5.040	100.8	10.100	101	19.700	98.5
9	0.973	97.3	1.920	96	4.910	98.2	9.770	99.7	19.600	98
10	1.030	103	1.960	98	4.890	97.8	9.820	98.2	19.700	98.4
RSD	3.17%	-	1.90%	-	1.50%	-	1.73%	-	0.94%	-

2.6 实际样品检测
对21组市售国内外葡萄酒样品进行高氯酸盐含量测定，包括3组白葡萄酒样品和18组红葡萄酒样品，平行测定3次，平均值作为最终检测结果，见表4。
根据表4可知，有7组样品检出^-ClO₄，检出率为33.33 %，出样品中有3组样品高氯酸盐含量小于1 μg·L^-1，3组样品高氯酸盐含量在1~15 μg·L^-1之间，1组样品含量为16.65 μg·L^-1，超过2009年美国环保署（US EPA）建议的饮用水中高氯酸盐浓度标准，因此监管部门有必要对市售葡萄酒进行监督管理。

表4 葡萄酒样品检测（n=21）

Table.4 Wine sample testing

样品编号 Sample serial number	测定值 measured value/μg·L^-1	样品编号 Sample serial number	测定值 measured value/μg·L^-1	样品编号 Sample serial number	测定值 measured value/μg·L^-1
1	-	8	-	15	-
2	-	9	-	16	0.65
3	16.65	10	8.97	17	-
4	-	11	-	18	0.56
5	10.65	12	-	19	-
6	-	13	3.58	20	0.60
7	-	14	-	21	-

注：-; 未检出not detected。
3 讨论
3.1 不同微孔滤膜对高氯酸盐净化效果的影响
实验结果表明，使用GHP滤膜净化样品对高氯酸盐的吸附性很小，聚醚砜滤膜对高氯酸盐的吸附作用比GHP滤膜强，尼龙66滤膜对高氯酸盐的通过率仅为0.9%。这可能是由于GHP滤膜（聚丙烯）的亲水特性使其可以同时应用于水溶液和有机溶液过滤，而葡萄酒本身为水和纯的混合溶液，同时GHP也是一种非吸附膜，可以防止目标分子的非特异性结合，使得高氯酸盐离子可以很好地通过GHP滤膜。聚醚砜滤膜特性则包括高流速、高通量、低蛋白吸附等，主要专门针对生物、制药行业和除菌过滤的需求，化学兼容性比GHP略差，因此对于葡萄酒基质来说，对高氯酸根的通过率比GHP低。尼龙66滤膜对高氯酸盐的吸附程度与吴映旋等人利用HPLC-GC/MS测定水果中高氯酸盐的结果相符，已知尼龙66滤膜的材质为聚己二酰己二胺，推测聚己二酰己二胺对高氯酸根离子具有很强的吸附性。
3.2 不同固相萃取柱对高氯酸盐分离净化效果的影响
通过比较WAX固相萃取柱和C18固相萃取柱的效果，发现WAX固相萃取柱在分离干扰物时可对目标化合物进行富集，增强对待测物的检出能力，这是由于WAX柱的填料为混合型弱阴离子交换吸附剂，对含强酸基团的化合物具有高选择性和灵敏度。而C18固相萃取柱的填充物是基于键合的反相（二甲基十八碳硅烷）和不规则硅胶（硅胶基）颗粒，这种非极性、未封端的吸附剂提供了与表面硅醇基相关联的额外的极性相互作用，与相应的封端的吸附剂相比增强了对碱性化合物的保留，因此对高氯酸根离子的分离净化效果较差。
3.3 不同色谱柱对高氯酸盐分离效果的影响
本研究中，C18色谱柱对高氯酸盐的保留效果明显低于Phenyl-hexyl色谱柱，推测这是由于高氯酸根离子带有负电荷，而C18色谱柱填充物为非极性物质导致，虽然Phenyl-hexyl色谱柱有较好的分离度和重现性，但本实验仅对两种色谱柱的保留效果进行比较，因此Phenyl-hexyl色谱柱是否为超高效液相色谱串联质谱方法的最佳色谱柱仍需进一步研究。
4 结论
本试验建立了UPLC-MS/MS测定葡萄酒中高氯酸盐含量的分析方法，最终检测时间12 min，检出限和定量限分别为0.15 μg·L^-1和0.5 μg·L^-1，在1 μg·L^-1~ 20 μg·L^-1的加标水平内的回收率在94.5%到105%之间，相对标准偏差（RSD）小于3.17%。经方法学验证和实际样品检测说明本方法适用于葡萄酒中高氯酸盐的检测，达到了低损快速检测葡萄酒中高氯酸盐的目的，为实现高氯酸盐的在线、快速、精确检测提供了借鉴。市售国内外葡萄酒中高氯酸盐的检出率为33.33%，检出范围0.56 ~ 16.65 μg·L^-1，最高值已超过US EPA规定的安全浓度限值，结合S Takatsuki利用离子色谱串联二级质谱技术对日本葡萄酒样的检测结果，发现市售葡萄酒受高氯酸盐污染的情况普遍存在，本方法的建立可以为葡萄酒生产企业和相关安全执法部门的检测提供技术支持。

参考文献：

分
该帖子已被版主-welewolf加10积分，加2经验;加分理由:鼓励原创