SCN--异烟酸-硫代巴比妥酸- CTMAB显色体系的研究及应用
黄选忠
(湖北兴山县疾病预防控制中心,443711)
摘要 在弱酸性介质中及溴化十六烷基三甲铵(CTMAB)和氯胺T存在条件下,硫氰酸盐(SCN-)与异烟酸-硫代巴比妥酸形成一蓝绿色染料,其最大吸收波长位于648nm,ε=4.30×104L·mol-1·cm-1,且其吸光度A与SCN-含量在一定的范围内呈良好的线性关系,建立了测定人尿中微量SCN-的异烟酸-硫代巴比妥酸- CTMAB显色光度法,本法SCN-含量在0~6.0μg/5.0mL范围内符合比耳定律,方法用于人尿中微量SCN-的测定,结果令人满意。
关键词 硫氰酸盐 CTMAB 分光光度法 异烟酸 硫代巴比妥酸
中图分类号:O657.3
硫氰酸盐(SCN-)是致甲状腺肿物质,可阻滞甲状腺激素合成,引起甲状腺肿,因此监测人血、尿等标本中的SCN-含量具有重要意义。同时尿中SCN-含量也是接触氰化物的一项生物接触指标,目前,测定尿中微量SCN-的方法主要有分光光度法、离子色谱法、顶空气相色谱法、衍生气相色谱法等,其中离子色谱法和气相色谱法均需要专门仪器,且耗时较长。分光光度法以其简便灵敏、设备简单而被广泛采用。已报道的分光光度法主要有异烟酸-吡唑啉酮光度法、吡啶-巴比妥酸光度法、三氯化铁显色光度法等,其中后两种方法的灵敏度较低,且所用吡啶有强烈刺激性及恶臭,能麻醉中枢神经系统,有损分析人员的健康,使其应用受到影响。异烟酸-硫代巴比妥酸-CTMAB显色光度法曾成功测定了饮用水中微量氰化物,但应用于人尿中微量SCN-的测定似未见报道。我们对异烟酸-硫代巴比妥酸-CTMAB显色体系光度测定人尿中微量SCN-进行了研究,结果表明,在弱酸性介质中,氯胺T将SCN-转化成氯化氰(CNCl),CNCl再与异烟酸-硫代巴比妥酸形成一蓝绿色染料,该染料的最大吸收波长(λmax)位于643nm,当有CTMAB存在时,该染料的λmax红移至648nm,其表观摩尔吸光系数(ε)也从3.26×104L·mol-1·cm-1提高到4.30×104L·mol-1·cm-1,增幅达30%以上,且其吸光度与SCN-含量在一定的范围内呈良好的线性关系(r>0.9997),建立了测定人尿中微量SCN-的异烟酸-硫代巴比妥酸-CTMAB显色光度法,该法SCN-含量在0~6.0μg/5.0mL范围内符合比耳定律,方法用于人尿中微量SCN-的测定,其结果与国家行业标准方法相吻合,加标回收率在96%~102.5%,方法的选择性、稳定性和灵敏度均令人满意。
1 实验部分
1.1主要仪器及试剂
TU-1810SPC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);SCN-标准溶液:1.0mg/mL的标准储备液,按文献的方法配制。临用时稀释成1.0μg/mL(A液)和10.0μg/mL(B液)的标准应用液;1.0mol/L的KH2PO4缓冲溶液:pH≈4.67;异烟酸-硫代巴比妥酸溶液:称取1.23异烟酸和1.08g硫代巴比妥酸加入少量纯水和1.0mol/L的NaOH溶液16~17mL,搅拌使其溶解后补充纯水至100 mL(此溶液pH为近中性,异烟酸和硫代巴比妥酸浓度分别为0.10mol/L、0.075mol/L);0.044 mol/L的氯胺T溶液(临用时配制):CTMAB溶液(含20%乙醇):0.20 mol/L。
以上试剂为AR级,试验用水为超纯水(18.25ΜΩ·cm)。
1.2实验方法
取SCN-标准应用A液0、0.20、0.50mL和B液0.10、0.20、0.40、0.60mL及新鲜尿样0.20mL((SCN-≤6μg))于10 mL比色管中,补充纯水至约0.5mL,加入1.0mol/L的KH2PO4缓冲溶液2.0 mL、氯胺T溶液0.25 mL混匀,放置4min,加入异烟酸-硫代巴比妥酸溶液2.0mL混匀,加入CTMAB溶液0.20并补充纯水至5mL刻度混匀,放置28min,以试剂空白为参比用1cm比色皿于648nm处测定各管吸光度A,以SCN-含量对A绘制标准曲线,以标准曲线法进行尿SCN-定量。
2 结果与讨论
2.1吸收光谱
在弱酸性介质中,SCN-与异烟酸-硫代巴比妥酸形成蓝绿色染料,其λmax位于643nm,当加入CTMAB后,其吸光度提高30%以上,且吸收峰红移至648nm,而相应的试剂空白在500~700nm范围内无吸收峰,见图1。
图1 吸收光谱
1. SCN--异烟酸-硫代巴比妥酸体系(对试剂空白)
2 SCN-(1.5μg)-异烟酸-硫代巴比妥酸-CTMAB体系(对试剂空白)
3 SCN-(2μg)-异烟酸-硫代巴比妥酸-CTMAB体系(对试剂空白)
2.2酸度的影响及缓冲溶液的用量
试验结果表明,pH值对该显色体系的影响主要在SCN-转化成CNCl的这一阶段,对后续显色阶段的影响相对较小,且溶液pH值在4.49~5.29的KH2PO4/Na2HPO4(0.25mol/L)缓冲介质中体系有最大稳定的吸光度,但尿样加标回收率偏低,而用1.0mol/L的KH2PO4溶液(pH≈4.67)时体系可达最大吸光度且尿样加标回收率较高,这可能与尿样的成分复杂产生的基体干扰有关,使用1.0mol/L的KH2PO4溶液可能抵消了尿样的基体干扰,试验选用1.0mol/L的KH2PO4溶液控制显色体系酸度,其用量在1.5-2.5 mL时体系有最大稳定的吸光度,试验选用2.0 mL。
2.3 SCN-转化时间及氯胺T溶液用量的影响
本试验条件下,SCN-转化成氯化氰的时间在3~5min ,0.044 mol/L的氯胺T溶液用量在0.20~0.35 mL体系有最大稳定的吸光度,试验分别选用4min 和0.25mL。
2.4异烟酸和硫代巴比妥酸溶液用量的影响
试验表明,异烟酸(0.20mol/L)和硫代巴比妥酸(0.15mol/L)溶液用量均在0.75~1.25mL体系有最大稳定的吸光度,试验均选用1.0mL。
2.5异烟酸和硫代巴比妥酸溶液混合加入试验
试验表明,异烟酸和硫代巴比妥酸分别以0.10mol/L和0.075mol/L的浓度配成混合溶液一次加入2.0mL,可使体系吸光度提高20%以上,且提高了工作效率。
2.6 CTMAB溶液的影响及用量
试验表明,适量的CTMAB可使SCN--异烟酸-硫代巴比妥酸显色体系的吸光度提高30%以上、体系的λmax从643 nm红移至648nm,证明形成了新的物质。0.20mol/L的CTMAB溶液用量在0.20~0.30 mL范围内体系有最大且稳定的吸光度,实验选用0.25mL。
2.7呈色稳定性
试验表明,SCN-与异烟酸-硫代巴比妥酸-CTMAB显色体系的吸光度在28-30min可达最大值且至少可稳定10min。
2.8共存物质的影响
根据本法显色机理,CN-因与SCN-一样,可与异烟酸-硫代巴比妥酸-CTMAB体系发生相同显色反应而产生正干扰,但正常尿液中CN-的含量甚微,其影响可忽略。但考虑到尿液的成分较复杂,其中含量较大的物质(主要有尿素、氯化钠、硫酸盐、磷酸氢盐、肌酐和氯化铵等)可能因基体效应对体系的显色反应产生影响,这在前述2.2结果中得到印证。为考察基体效应对体系显色反应的影响,按照尿液正常成分配制成含尿素(20g/L)、Cl-(13g/L)、Na+(9g/L),HPO42-、SO42-(2.0g/L)、肌酐(1.4g/L)、NH4+(0.93 g/L)的尿液对照液, 取0.20-0.40 mL尿液对照液加入2.0μg SCN-测定吸光度,结果表明,至少二倍于尿样中的上述成分对2.0μg SCN-的测定结果基本无影响(吸光度误差在±5%范围内),可见方法的选择性良好。
2.9标准曲线
本法SCN-含量在0~6.0μg/5.0ml范围内符合比耳定律(标准色阶见图2),标准曲线的回归方程及由曲线斜率法求得的ε为:
A=0.1484C(SCN-,μg)-0.0029,r=0.9997,ε=4.30×104L·mol-1·cm-1
本法最低检出量为0.2μg、当取样量为0.20mL时,方法最低检出浓度为1.0mg/L。
图2 0~6.0μg SCN-/5.0ml的标准色阶
2.10精密度实验
对0.20、0.50、2.00和4.00μg SCN-标准液平行测定5次,测定结果见表1,从表1可见,四水平测定结果的相对标准偏差(RSD)分别为4.54%、3.15%、2.46%和1.66%,表明方法的重复性良好。
表1 重复性试验结果
SCN- | 测定值/ | 平均值/ | RSD/ |
(μg ) | (A) | (A) | % |
0.20 | 0.025,0.026,0.027,0.029,0.027 | 0.027 | 4.54 |
0.50 | 0.068,0.070,0.071,0.072,0.074 | 0.071 | 3.15 |
2.00 | 0.292,0.308,0.289,0.299,0.297 | 0.297 | 2.46 |
4.00 | 0.577,0.589,0.592,0.585,0.602 | 0.589 | 1.56 |
2.11尿样分析结果
取6份尿样按试验方法1.2操作测定SCN-含量,同时用吡啶-巴比妥酸分光光度法 作对照分析,并进行加标回收试验,本法结果与行业推荐标准方法相吻合,加标回收率在96.0%~102.5%,见表2。
表2 尿样分析结果
样品编号 | 本法结果 | 标准方法结果/ mg/L |
结果均值/ | 加入量/ | 回收率/ | RSD/ |
mg/L | μg | % | % (n=5) |
1 | 12.8 | 2.00 | 102.5 | 1.99 | 12.5 |
2 | 6.9 | 5.00 | 100.8 | 2.29 | 6.8 |
3 | 7.3 | 4.00 | 100.5 | 2.17 | 7.4 |
4 | 15.2 | 0.50 | 96.0 | / | 15.8 |
5 | 8.9 | / | / | / | 8.8 |
6 | 4.6 | / | / | / | 4.4 |
参考文献
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(黄选忠,主任技师,研究方向:卫生化学检验技术。工作单位:兴山县疾病预防控制中心,联系电话:13872688318,E-mail:xscdchxz@sina.com)