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二维液相色谱紫外检测法分离婴幼儿配方食品中维生素A、E和D的应用

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2020/06/23
仪信通会员战队

背景
维生素A、D、E是人与动物维持正常代谢和机能所必需的脂溶性维生素。维生素A具有促进机体生长、维持表皮完整等功能。维生素E又称为生育酚，由于母生育酚环上甲基取代的变化有8 种活性形式，包括α、β、γ、δ－生育酚或三烯生育酚主要5种，其中α－生育酚因为活性最高，具有抗氧化、抗衰老等作用。维生素D主要包括维生素D₂(麦角钙化醇)和维生素D₃(胆钙化醇)，对哺乳动物具有促进钙磷代谢及成骨作用。以上脂溶性维生素已作为营养强化剂添加在各种食品和饲料中，尤其在婴幼儿及成人配方乳品和动物饲料是脂溶性维生素强化的两种重要形式。在实际样品中，维生素A 和维生素E 通常添加量较高，受基质干扰较小，可直接经色谱分离测定，但是分析界一直希望用易推广的反相色谱柱取代不宜普及的正相色谱分离维生素A和E测定，一次将维生素A（视黄醇）和维生素E（八种生育酚异构体）完全分离。而维生素D 具有营养与毒性添加范围被限制在200-400IU/日，由于维生素D对紫外吸收也相对较弱，同时存在杂质的干扰，现行国家食品安全标准方法采用了同位素稀释液质联用法和制备正相净化富集，反相液相外标法定量的双色谱法。鉴于液相色谱质联用方法成本相对较高而难于在企业普及；而双色谱法的正相方法易受样品含水、流分收集难控制、操作繁琐、耗时等因素影响成为目前维生素分析中的难点。

本方法是在超高效二维液相色谱(UPLC- 2D)方案的基础上，在反相色谱条件下，一次进样同时完成维生素A（视黄醇），α、β、γ、δ-生育酚和α-三烯生育酚（维生素E）和维生素D₂、D₃的分离测定，整个分离耗时仅需25 分钟。维生素A 和α、β、γ、δ-维生素E在一维被完全分离，而维生素D 在一维经初步分离净化后被切割至捕集柱滞留，再切换进入二维色谱柱得以进一步分离，实现了维生素D₂和D₃的基线分离。通过对实际样品进行基质添加考察，以及对QC样品的分析，结果表明，维生素A、维生素E 和维生素D 按国标要求范围内线性良好,标准曲线相关系数，重现性佳，5 针重复进样保留时间RSD <0.5%，峰面积RSD <2%，维生素D(D₂、D₃)检出限可达到 0.5 μg/kg。

实验材料与方法

样品预处理

皂化：称取 2-5 g经均质处理的固体试样(或 50 g液体试样)于250 mL平底烧瓶中,固体试样加入20 mL温水,混匀；含淀粉样品：加入0.5 - 1g 淀粉酶，放入60 ˚C水浴避光恒温振荡30 min后，取出；将上述处理液中加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT，混匀，加入无水乙醇50 mL，氢氧化钾10-20 mL，75-85 ˚C水浴皂化20-30 min，冷却至室温。

提取：将皂化液用30 mL水转入250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚-乙醚混合液，振荡萃取5-10 min，将下层溶液(皂化液）转移至另一250 mL分液漏斗中；在另一 250 mL分液漏斗中，再加入50 mL混合醚液再次萃取；合并两次萃取液。

注：如果只测维生素A和α-生育酚，可用石油醚作提取剂。

洗涤：用约100 mL水洗涤醚层，需重复3次，直至将醚层洗至呈中性（可用pH试纸检测下层溶液pH值）；弃去下层水相。

浓缩：将洗涤后的醚层经干燥的无水硫酸钠（约3 g）滤入250 mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中，用15 mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，一同并入蒸发瓶内；40-45 ℃水浴减压蒸馏或者气体浓缩至约2 mL，微流氮气吹至近干；用甲醇分次将蒸发瓶中残留物转移并定容至2或5 mL容量瓶中，溶液过0.22 μm有机系滤膜，上机测试。

注：当待测维生素D含量较低，需要扩大进样体积时，括适当稀释溶剂强度以降低溶剂效应（如使用初始流动相转移残留物并定容）。

色谱分析条件

仪器系统： Waters ACQUITY Arc 2D

系统配置：QSM1（四元泵1）+ QSM2（四元泵2）、FTN进样器 + Column、Manager (CM-A) 柱温箱（内置2位-6通阀）+ 2998 PDA检测器；

流动相： A：水；B：甲醇；C: 乙腈

一维分析色谱柱： ChromCore PFP（4.6 x100 mm，3 μm）或相似者

二维分析色谱柱： Cholester胆固醇键合相柱（3.0mmX150mm，2.6um）或相似者

捕集柱： XBridge BEH C18 Direct Connect HP 捕集柱（2.1 mm x 30 mm, 10 μm）或相似者

柱温：一维40 ˚C，二维40 ˚C

检测波长：一维VA：325 nm（0-12 min）;VD: 264 nm（6.5-7.5 min）VE: 294 nm （0-12 min）,

二维VD2和VD3：264 nm（12-20 min）

进样量: 20-50 μL

采用梯度洗脱（需依据不同厂家的色谱柱自行优化）

结果与讨论

1. 色谱条件条件的优化

本实验所选择的色谱分离的关键在于柱子的选择与色谱条件的优化。

1.1 一維柱子的选择：

经使用不同类型柱子比较，发现纳谱公司的硅胶基质五氟苯基键合相的反相色谱柱（PFP）对维生素A具有较好的保留，采用复杂基质的配方乳粉样品进样可将维生素A与杂质完全分离，并保持较好的峰型（参见图1-a）.分离的另一个关键点是维生素E的两个异构体β-与γ－生育酚的完全分离，PFP柱具有完美的分离能力（参见图1-b）。

1.2 二維柱子的选择：

二维分离的对象主要是维生素D中D2与D3的分离，柱子的选择要求是两个组分达到完全分离。经选择优化：Cholester胆固醇键合相柱是理想的首选柱子（参见图2-c）。

1.3 色谱条件的优化

国标中使用的流动相是甲醇与水，一維的流动相是甲醇与水，考虑到维生素A和维生素E的四个异构体必须达到完全分离，同时兼顾维生素D的良好切割。采用梯度洗脱（参见表1-a）。二维的分离目的是维生素D2与D3分离，选用乙腈与水作为流动相可达到完全分离的需要（参见表1-b）.切换阀的准时使用对维生素D的分离至关重要，右阀切换（位置1）之目的是将维生素D准时地收集到捕集柱中，同时回切（位置2）意味着将捕集柱中维生素D切换到二维分离去。左阀切换（位置2）之目的是把色谱的紫外检测器采集通道及时地从对维生素E（295 nm）采集切换到二维对维生素D（264nm）采集上来，左阀在结束时在回切（位置2）。

1.4 二维色谱分离示意图:

在分离过程中在柱子与流动性确定以后，关键是在梯度程序的优化，以及切换阀的切换时间的确定方面需要进行反复的摸索与优化，一旦确定后便是可进行方法学的验证，进入实际样品的测定。图3-a示意了维生素D右阀切换的情况（），以及在20分钟是检测器检测通道左阀切换后监测264nm的情况。图3-b 上下分别是波长325nm和295nm的检测维生素A和维生素E的色谱图。

1.5 分离稳定性情况:

维生素 A、E 和 D 的重复性测定（五次）的情况（参见图4），结果表明重复性十分理想，尤其是A和E(一維)，而二维的波动较为大一些，但也在合理范围之中。

1.6 实际样品的检测：

应用本方法对婴幼儿配方乳粉，预混料进行了实际检测，结果见图5和表2.其检测的分离度、灵敏度均可满足实际样品检测。

结论

针对目前食品营养素分析中存在的困难，本方法可解决分析中存在预处理半制备时间长、操作繁琐、分离难度大、结果数据波动大等问题。采用一維五氟苯基键合相柱与二维胆固醇键合相柱结合的二维色谱，使用甲醇、乙腈和水作为流动相的二维反相液相色谱系统，建立一次性进样分离维生素A、E和D，并准确定量的方法，经实际样品检测结果验证，获得了令人满意的结果。该方法具有推广应用的价值。

本文为【纳谱分析第一有奖征文活动】获奖作品，作者信息：

任一平，浙江清华长三角研究院国家食品安全风险评估中心应用技术合作中心副主任、总工程师，中国色谱学会常务理事、浙江省分析测试学会副理事长和浙江省化学会色谱专业委员会理事长，浙江省疾控中心理化检测所名誉所长

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