水产品中大环内酯的提取与检测
背景
大环内酯类抗生素（Macrolide antibiotics，MALs）是一类具有12-16个碳内酯环的抗生素类群，是一类应用广泛的兽药。滥用或者不当使用该兽药时，可能会导致动物性食物中抗生素的残留，通过食物链，进入人体内，在体内积累到一定浓度时，会对人体的前庭和耳蜗神经造成损害，严重者会对肝肾造成损害。为保障食品安全，我国农业部235公告对食用性组织中大环内酯的最大残留量做出了规定，同时国家标准GB 31660.1-2019中也规定了水产品中大环内酯的测定方法。因被测样品基质较为复杂、可能会存在基质效应的干扰，样品必须经过固相萃取柱的净化方可进行后续测定，纳谱分析的SelectCore Alumina N可完全满足国标检测需求，具有滴速快、干扰杂质去除率高、回收率稳定等诸多优势。
适用范围
参照GB 31660.1-2019 食品安全国家标准 水产品中大环内酯类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法，本方法适用于水产品中鱼、虾、蟹、贝类等的可食组织中竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素9种大环内酯类药物残留量的检测。
实验步骤
1、样品制备
参照GB 31660.1-2019样品提取方法，称取样品5 g（准确至±20 mg）于50 mL塑料离心管，加入乙腈20 mL，于旋涡混合器上以2000 r/min旋涡1 min，超声5 min，以3500 r/min离心6 min，取上清液转移至另一离心管中，残渣再加乙腈15 mL，重复提取一次，合并上清液，备用。
2、净化
SPE柱：SelectCore Alumina N 2000mg/6mL固相萃取柱；
活化：加入5.0mL乙腈活化，保持柱体湿润；
上样：加入步骤1中制备好的全部上清液，并收集上样液；
洗脱：用5.0 mL乙腈洗脱，收集全部洗脱液；
洗脱液于40 °C旋转蒸发至干。用2 mL乙腈溶解残余物，涡旋混匀，过0.22 μm尼龙滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。
3、液相色谱仪器条件
Column: ChromCore C181.8 μm
Dimension: 2.1×50mm
Mobile Phase: A) 0.1% HCOOH
B) ACN
Gradient:
t (min) | A | B |
0.00 | 90 | 10 |
3.00 | 60 | 40 |
6.00 | 20 | 80 |
6.50 | 0 | 100 |
7.50 | 0 | 100 |
7.60 | 90 | 10 |
11.00 | 90 | 10 |
Flow Rate: 0.4 mL/min
Temperature: 30 °C
Injection: 2 μL
4、质谱仪器条件
ESI in positive ionization mode
Ion Spray voltage: 4000V
Source Temperature: 300℃
Nebulizer Gas: 45psi
实验谱图及加标回收率数据
实验谱图
图1：20 ng/mL 9种大环内酯类药物标准溶液的多重反应监测（MRM）色谱图
图2：鱼肉空白样品里的9种大环内酯类药物的多重反应监测（MRM）色谱图
图3：鱼肉样品中添加量为8μg/kg的9种大环内酯类药物的多重反应监测（MRM）色谱图
图4：鱼肉样品中添加量为16μg/kg的9种大环内酯类药物的多重反应监测（MRM）色谱图
加标回收率数据
保留时间（min） | 化合物（中文） | 化合物（英文） | 加标量（μg/kg） | 平均回收率% |
4.463 | 竹桃霉素 | Oleandomycin | 8 | 107.5% |
16 | 99.5% |
4.687 | 红霉素 | Erythromycin | 8 | 94.0% |
16 | 91.3% |
5.285 | 克拉霉素 | Clarithromycin | 8 | 92.4% |
16 | 90.5% |
5.284 | 阿奇霉素 | Azithromycin | 8 | 90.7% |
16 | 90.2% |
5.168 | 吉他霉素 | Kitasamycin | 8 | 94.6% |
16 | 86.3% |
5.589 | 交沙霉素 | Josamycin | 8 | 92.5% |
16 | 88.3% |
5.853 | 螺旋霉素 | Spiramycin | 8 | 90.3% |
16 | 88.6% |
4.240 | 替米考星 | Tilmicosin | 8 | 108.5% |
16 | 103.1% |
4.933 | 泰乐菌素 | Tylosin | 8 | 101.1% |
16 | 92.5% |
实验结论
由图2可以看出，鱼肉空白样品基质干扰较大，严重影响对目标物的辨别，但经过SelectCore Alumina N净化后，如图3中所示，目标物清晰可见，易于判别。9种大环内酯类药物的加标回收率均在85%以上，符合国标规定的准确度的标准，并且两种不同浓度的加标量，回收率均能有所保证。使用纳谱分析的ChromCore C181.8 μm规格为2.1×50mm的色谱柱，缩短了分析时间，提高了检测效率。
写在后面：
1. 与纳谱的初次相识要从2019年初一根钙柱说起，当时公司急于检测一批样品，找不到合适的柱子，这时候纳谱的销售向我们推荐了这根救我们于水火之中的钙柱。一开始可能是因为我们对产品的不熟悉导致使用并不顺利，但销售第一时间联系了对应的应用工程师帮助我们解决了问题。后来，接触到纳谱的固相萃取柱也是一次缘分，有机会向纳谱的技术负责人当面学习了好多关于填料合成及应用原理各个方面的知识，不禁激起我们对纳谱产品的兴趣，于是，开启了长时间的使用纳谱色谱柱和固相萃取柱的愉快之旅。
2. 关于水产品中大环内酯的提取与检测，GB 31660.1-2019中提到使用Alumina N小柱，我们同时使用了几家产品做检测，从实验过程和结果分析表明，纳谱小柱流速较快可控，不易堵住，且回收率水平一致，满足标准要求。
3. 再次点赞纳谱的技术支持。在实验过程中出现错误使用小柱的问题，导致回收率很低，向技术人员描述了实验过程后，技术第一时间指出问题所在，给予解决。
本文为【纳谱分析第一有奖征文活动】获奖作品，原作者信息：
单位：安徽中青检测
姓名：宋**
前处理小柱：纳谱分析SelectCore Alumina N 2000mg/6mL固相萃取柱
色谱柱：纳谱分析ChromCore C18 1.8 μm，2.1×50 mm
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