总巯基的测定是将提取的蛋白溶液稀释2mg/mL，向测定组加入5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸DTNB(Ellman1959;Martinaud et al.1997);向对照组加入磷酸钠盐缓冲液，避光振荡后于412nm测量其吸光值。 二硫键的测定是向蛋白溶液中加入2-硝基-5-硫代磺基苯甲酸(NTSB)试剂，避光反应，震荡15min后。于412nm测量其吸光值。
如图3-1所示，对于添加亚硝酸钠的试验组，不论在MPR还是MPC中其羰基的含量随着亚硝酸钠添加量的增加而明显降低。在MPR和MPC中,随高剂量亚硝酸钠(>100mg/kg)的添加，较无亚硝酸钠火腿中的肌原纤维蛋白相比，羰基的含量降低了大约一倍。对于不同浓度NaNO2的MPC，羰基含量随NaNO2浓度的增加而降低，羰基含量和NaNO2的添加量呈现负相关这表明NaNO2具有抑制羰基形成的作用。因为铁离子可以催化如赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、脯氨酸残基氧化去氨基反应，进而产生了羰基，而NaNO2对铁的鳌合作用是其能抗氧化的一个重要性质(Chen et al. 2013;Utrera and Estevez 2013)。此外，以肉为原料的食物成分复杂，与NaNO2反应也多种多样，反应可以生成具有抗氧化性质的产物，例如亚硝胺_肌红蛋白，就是由NO和脂质氧化的中间产物结合的(Skibsted 2011; Sulliva and Sebranek 2012)。Vossen和Smet(2015)发现在肉的模型中羰基水平有轻微的降低，这个发现与本研究的结论相符合。羰基能与亲核试剂发生反应(如赖氨酸的g-NH2)，所以会导致总羰基和游离氨基的减少( Estevez 2011;Lietal. 2012)。在熟火腿中，加热处理会促进羰基-氨基相互连接，这也解释了亚硝酸盐处理过的MPC中羰基含量比同处理的MPR含量低(Villaverdeetal.2014;VossenandDeSmet.2015)。通过相关文献的查阅，对于肌原纤维分离蛋白，NaNO2的过氧化性表现在羰基的形成。这与我们发现的结论相悖，但这也可能是由于肌原分离蛋白中的活性物质不同引起的，包括活性氮原子，在体外富含氢氧自由基，就会促进羰基的形成。在反应中也会测定游离氨基，来证实肌原纤维蛋白的理化性质的改变(Skibsted 2011)。
3.2总巯基与二硫键
通过对MPR和MPC总巯基的测定，发现NaNO2的添加量会影响总巯基的含量，见图3-2。MPR经过NaNO2的处理后，巯基的含量明显减少，而且随NaNO2 的添加量不断增多，巯基的含量降低的越明显。在MPC中其所表现出的结果与MPR也相似。Sullivan和Sebranek(2012)发现巯基含量的降低与亚硝酸钠的增加具有相关性。Vossen和DeSmet(2015)也有类似的发现，即添加180mg/kg的亚硝酸钠会降低巯基的含量，这也有利证实了本研究的结果。在本研究中还发现MPR经亚硝酸钠处理过，其巯基含量显著减少。蛋白质的巯基在加热的情况下也会与亚硝酸钠发生亚硝基化反应，这也会.使巯基的含量降低;从图中看出MPC中巯基含量低于MPR，这也说明了加热处理对其也有显著的影响。 氨基酸残基中的巯基极易被氧化，亚硝酸钠可以通过获取肉体系中不稳定分子中的电子，激发氧化反应，造成了巯基相互键连形成二硫键，如图3-3所示，在用亚硝酸钠处理过的样品组内均发现了二硫键的增多，较对照组(无亚硝酸钠处理)呈极显著性差异，大约是其1.4-4.6倍。然而并不是所有减少的巯基都转化为二硫键还有一部分巯基氧化还会形成磺酸或次磺酸( Sullivan and Sebranek 2012;Estevez 2011;Liet al.2012)。相关文献也提出，肉制品经加热处理会促进二硫键的形成(Rahamanetal.2015)，这也解释了熟火腿中的二硫键含量会高于生火腿的原因了。此外，二硫键的形成也会提升肉制品的凝胶性。
3.3 二聚酪氨酸交联
二聚酪氨酸，是一个表征蛋白理化性质改变的重要指标，已在肉品的模型中得到证实(Lund et al. 2008)。二聚酪氨酸是酪氨酸被氧化，形成酪氨酰苯氧基自由基，聚合而成。从图3-4可看出，添加亚硝酸钠处的MPR与没添加亚硝酸钠的MPR相比，二聚酪氨酸的含量降低四倍，这表明添加亚硝酸钠能阻止MPR中二聚酪氨酸的形成，而其能抑制的原理与抑制羰基形成类似。此外，在亚硝酸钠的存在下会发生亚硝化，一些在蛋白表面.上的酪氨酸残基会发生反应生成3-硝基酪氨酸，它可以阻止二聚酪氨酸的交联(Bertramet al.2007; Traore et al.2012)。而肉制品中的二聚酪氨酸的形成很少有文献提及，所以它们之间的相互作用需要更为深入的研究。剧烈加热会加剧MPC中二聚酪氨酸形成，这种情况导致了MPC中的二聚酪氨酸含量都升高，加热处理可以增强蛋白内部酪氨酸残基暴露，因此MPC中二聚酪氨酸的含量明显增加。加热处理会在一定层度上掩盖亚硝酸钠抑制二聚酪氨酸交联的作用，所以从结果中可以看出不同亚硝酸钠浓度的火腿(50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg)二聚酪氨酸的含量会依次递减但并没有呈现一定规律。
在肌原纤维蛋白中分子内与分子间的共价交联通常用肌球蛋白重链(MHC)在凝胶电泳的迁移率来分析。如图3-6，A、B代表不同NaNO2浓度MPR和MPC的电泳图谱;C、D代表不含β-巯基乙醇和含β-巯基乙醇的MPR、MPC的电泳图谱。从图上的条带可以看出，在MPR中肌球蛋白重链的条带的亮度随亚硝酸钠的添加量增多而变暗，大部分都集中在分离胶上部，而其经过β-巯基乙醇处理过其重链强度会更明显。从图上条带的变化情况，也表明了改变大分子的迁移率的主要原因是二硫键的交联。SDS-PAGE的结果与上述巯基与二硫键的变化相符。而加热处理明显改变了肌球蛋白重链的粗细,不论是否用β-巯基乙醇处理过，MPC试验组的重链要明显细于生火腿中的重链。这说明了加热处理会引起蛋白之间的聚集(Jongberg et al.2015)。与MPR对比，MPC中蛋白质的聚集并不只是由二硫键造成的，还有一些其他的共价相连如酪氨酸-酪氨酸，羰基-氨基等反应(Liet al.2012)。
试验过程中发现蛋白质里存在3-硝基酪氨酸(3-NT)。如图3-9所示，3-NT 的含量随NaNO2的增加而升高，从而推测3-NT可能是蛋白亚硝基化的产物。氮自由基由亚硝酸钠激发有硝化力，引起蛋白质亚硝化(Villaverde etal. 2014)。在亚硝化作用下，酪氨酸的改性是由于氮自由基(包括过氧亚硝基和NO2)和酪氨酸残基反应而成(Pacheretal.2007)。3-NT被用于蛋白质亚硝基化的标记物，它的含量可以用液相或是免疫印迹法测量。从图中看出，加工处理中形成的3-NT在MPR和MPC中的差异很大。加热处理降低了N端氨基酸残基的稳定性。这解释了生火腿的3-NT含量远高于熟火腿。目前的--些研究发现抗坏血酸的添加抑制了亚硝胺的形成，降低了致癌风险(Sindelar and Milkowski 2011)。Villaverde等人(2014)发现抗坏血酸和亚硝酸钠反应可以产生NO,NO能进一步与超氧化物自由基反应形成过氧硝酸盐，过氧硝酸盐可以启动蛋白质的亚硝化作用，产生3-NT，然而一些学者之间也有些见解上的冲突，而相互矛盾的结果并没有合理解释清楚。抗坏血酸可以抑制蛋白的亚硝化而且添加量越高抑制越明显。然而，他们也说当抗坏血酸浓度为250mgkg时，3-NT含量会随着亚硝酸钠添加量升高而增加;其他研究还发现无血红素蛋白质在亚硝酸钠的作用下可以亚硝基化形成3-NT(Wool ford et al.1976)。
酪氨酸硝化作为一种由氮自由基引起的蛋白质氧化的标记物应用在人类的疾病中(Ischiropoulos2009)。因此,将蛋白质理化性质和结构性质与3-NT之间关系进行研究，通过皮尔森相关性分析发现3-NT的含量与蛋白质氧化指标具有密切关联，见表3-1、表3-2。在MPR中，3-NT 的含量与巯基含量和表面疏水性呈明显的负相关，更显著的是，在MPC中3-NT与羰基含量和巯基含量呈负相关，但与二硫键具有正相关性。这对于研究亚硝基化对蛋白质结构和功能的影响具有一定难度。而在体外进行对蛋白质亚硝基化-.定会伴随蛋白氧化的发生。亚硝酸钠可以产生氮自由基，例如过氧硝酸盐这种物质可以引发蛋白质氧化和亚硝基化(SouzaandPeluffo2008)。而酪氨酸残基会与氮自由基反应生成3-NT，在蛋白氧化过程中不乏抑制了羰基的形成(Pacher et al. 2007)。蛋白质残基如半胱氨酸和蛋氨酸更容易受到硝化剂的攻击(AlvarezandRadi2003)。所以，并没有抑制二硫键的形成。
NaNO2在西式火腿中不仅能发色，还具有抗氧化特性。在测定NaNO2对脂质氧化的影响时常采用丙二醛法测定。在MPR和MPC中丙二醛的含量都随NaNO2的含量增加而减少。在亚硝酸盐的添加量在50~400mgkg范围上丙二醛的含量大约降低2~9.6倍。这个结果体现了NaNO2不论在MPR还是MPC中都具有抗脂质氧化的作用。NaNO2的抗氧化性和抗脂质氧化的性质归因于NaNO2能打破自由基链(Skibsted 2011)。然而，NaNO2也被认为有过氧化的潜质(Brannan et al.2001)。亚硝酸盐可以减少NO或是过氧化硝酸盐的生成，而且还能从易氧化的化合物中捕捉电子进而发生氧化还原反应。抗坏血酸在腌肉制品中常常是用做阻止N-亚硝胺的形成，它可以和金属离子结合发生过氧化反应，形成羟自由基。因此，在氧化还原反应中亚硝酸盐的化学性质与变化是非常复杂的，这些反应并不是全部都可以解释清楚。例如，很多学者都对亚硝酸盐在肌原纤维分离蛋白中氧化稳定性的影响进行研究(Vllaverdeetal.2014)，但是他们并没有注重在肉制品中亚硝酸盐对蛋白质氧化的影响。
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