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CNS_08.141_茶黄色素

enhua

2021/07/26

食品添加剂

茶黄色素

魏林涛

2021.7.21

对于茶黄色素的研究

摘要：茶黄色素是一类由多酚类及其衍生物氧化缩合而来的多酚类物质，具有抗菌、抗病毒、抗脑血管疾病、抗氧化、抗肿瘤等作用和功能，因而受到国内外的广泛关注，称为茶叶品质化学与功能成分的研究热点，被列为国家科委“九五”重中之重“1035”工程项目。本文从茶黄色素的理化性质、药理作用及检测方法进行了综述。

关键词：茶黄色素，理化性质，药理作用，检测

1、引言

茶黄色素又称茶黄素，是存在于红茶中的一种金黄色色素，是茶叶发酵的产物。在生物化学上，茶黄色素是一类多酚羟基具苯骈酚酮结构的物质，是第一个从茶叶中找到具有确切药理作用的化合物。茶黄色素在茶汤中鲜亮的颜色和浓烈的口感方面，起到了一定的作用，是红茶的一个重要的质量指标。茶黄色素最早由Roberts发现，指红茶中溶于乙酸乙酯呈橙黄色的物质，由多酚类及其衍生物氧化缩合而来，红茶中茶黄素类的含量一般为0.3%～1.5%，对红茶的色香味及品质起着决定性的作用。茶黄色素以多酚类物质、儿茶素为主要成分，还含有氨基酸、维生索C、维生素E、维生素A原、黄酮及黄酮醇等。茶黄素是茶色素的主要成分，共有12种组分，其中茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3，3’-双没食子酸酯和茶黄素-3’-没食子酸酯是4种最主要的茶黄素。

2、茶黄色素的理化性质

茶黄素单体呈橙黄色针状晶体，熔点在237-240℃，易溶于水并且也易溶解在部分有机溶剂中，难溶于乙醛，不溶于氯仿和苯。茶黄素的水溶液呈鲜亮的橙黄色，呈弱酸性，pH约为5.7，在酸性条件下相对稳定，味苦涩，在波长280、380和460 nm处有吸收，其中在280 nm处有最大吸收峰。

1. 茶黄素的化学结构

儿茶素类化合物（C、EC、GC、ECG、ECC和 EGCG等）在多酣氧化酶的催化下，通过与空气中氧气进行氧化缩合形成茶黄素。在前期的研究中，已报道28种茶黄素的化学结构，如下图1所示。

2. 茶黄素的稳定性

茶黄素类物质因其具有苯骈卓酚酮结构和含有多个酚羟基，性质活泼，易被氧化，热稳定性较差，随着水温、pH的升高，茶黄素的稳定性均会降低。Su等对儿茶素和茶黄素混合物稳定性的研究表明，水溶液温度为24℃，茶黄素总量在3h内几乎没有变化;水温为70℃时，3h后茶黄素总量保留44%；水温为100℃时，3h后茶黄素几乎全部氧化降解。茶黄素在pH 为6.5时非常稳定，当pH为7.0时发生缓慢降解，当pH为9.0时降解迅速。光照可以降低茶黄素的稳定性，在避光条件下，茶黄素比较稳定；在光照条件下，6 h后茶黄素降解20%左右，说明茶黄素应避光保存。

3. 茶黄素的形成机理

儿茶素在多酚氧化酶的催化作用下，被空气中的氧气氧化成邻醌，邻醌极易产生聚合反应，形成中间产物联苯酚醌类，具有不稳定性的联苯酚醌，极易进行自身歧化作用，一部分还原形成黄烷醇，另一部分氧化缩合形成茶黄素。目前研究茶黄素类的形成途径大概可分为以下5种：儿茶素（B环上3、4位存在2个酚羟基）B环上的3，4-二羟基与没食子儿茶素（B环上3、4、5位存在3个酚羟基）在多份氧化酶（PPO）的催化作用下，各自被氧化成邻醌，生成的邻醌间配对，进行聚合反应形成茶黄素及其没食子酸酯。②儿茶素或没食子儿茶素都可以与邻苯二酚、邻苯三酚、没食子酸等物质氧化发生邻醌反应，从而生成茶黄棓灵或茶黄酸。③儿茶素B环上的3，4-二羟基与儿茶素D环上的没食子酰基氧化形成具有苯骈卓酚酮结构的茶典烷酸酯类物质。④茶黄素没食子酸酯可继续与表儿茶素进行苯骈环化反应而生成具有2个和3个苯骈卓酚酮环的茶黄素类物质。⑤茶黄素自身可继续发生聚合反应生成具有2个苯骈卓酚酮环的双茶黄素。[1]

图1 茶黄素的化学结构

3、茶黄色素的药理作用

1. 抗菌作用

原征彦等研究发现TFs及单体对肉毒芽孢杆菌、肠类杆菌、金黄色葡萄球菌、荚膜杆菌、蜡样芽孢杆菌和志贺氏细菌，均有明显的抗菌抑制作用。茶黄素各单体之间具有协同抑菌作用。Toed M.等也证实了TFs对黄色葡萄球菌的抑制作用。TF - 3，3’- DG在0.5 mg·mL-1的浓度下可抑制须发癣菌和红色发癣菌的生长。绿茶、乌龙茶提取液在5 mg·mL -1浓度时可完全抑制白癣菌的发育，红茶提取液抑制白癣菌发育的浓度更低。红茶提取液对百日咳菌有很强的灭杀作用，茶黄素没食子酸酯l mg·mL-1浓度24小时内完全杀灭百日咳菌。还可使霍乱弧菌Vibrio cholera凝聚而无活性，与细菌接触1h可使弧菌致死。0.3 μL·mL-1红茶提取液可使霍乱弧菌溶血活性抑制71%，同时可抑制其毒素对仓鼠卵巢细胞的毒性。红茶的TF能杀灭病原性大肠杆菌0157，使细菌细胞膜破坏。

Massao H.等研究发现TF1、TF - 3 - G 、TF - 3’- G和TF -3，3’- DG在l×10-3 ~ 10× 10-3 mol·mL-1浓度时对导致龋齿的细菌GTF（葡萄糖基转移酶）有强烈抑制活性，其抑制作用强度TF -3，3’- DG> TF - 3 - G> TF - 3’- G> TF1> CC> GCC> ECG> ECCG。Yoshno K．等10×10-3mol·mL-1浓度的TF1、TF -3 - G、TF- 3'- G和TF -3，3’- DG抑制葡聚糖形成，其抑制率分别为98% 、97% 、97%和98%。Tanaka N.等研究与龋齿有关的α-淀粉酶发现，红茶提取液能专一地降低淀粉酶的活性；作用强弱依次为TF -3，3’- DG> TF -3 - G> TF -3’- G> TF，并认为茶黄素结构中两个C环上C3和C13有没食子酰基基团呈现强抑制作用，效应可增强10倍。

2. 抗病毒作用

Nakayamu M.等研究发现TF – 3，3’- DG对流感病毒的侵染有一定的抑制作用，其机理是抑制病毒吸附在细胞上，而不是抑制病毒在细胞中的复制。Mukoyama A.等还发现TF - 3、3’- DC具有抑制猕猴肾MA104细胞系对轮状病毒和肠病毒的感染作用。红茶提取液中TFs可使牛状病毒和冠状病毒的侵染失效。80 mg·mL-1红茶提取液可完全抑制人轮状病毒。最引注目的是红茶提取液及TFs具有抑制艾滋病病毒。Nakane H.等研究发现TFs对艾滋病毒I（HIV–I）的逆转录酶以及各种细胞的 DNA 和 RNA聚合酶活性具有抑制作用，TF1、TF -3 - G、TF - 3’- G、TF - 3，3’- DG对 HIV -Ⅰ逆转录酶的抑制常数（Ki）分别为0.49、0.032、0.023、0.023， TFs中没食子酰基基团的存在可提高TFs抑制的效应。

3. 抗心脑血管疾病作用

茶色素具有抗心脑血管疾病是近几年研究的热点之一。楼福庆发现茶色素具有显著的抗凝，促进纤溶，防止血小板粘附附聚，抑制动脉平滑肌细胞增生的作用，能有效地预防动脉粥样硬化症。彭兰等对茶色素改善血液流变性的研究表明：10项血液流变学指标，除红细胞压积（HCt）下降不明显外，全血比粘度（ηb）、血浆比粘度（ηp）、纤维蛋白原（Fb）、全血还原粘度（ηr）、红细胞电泳时间（EPT）、血小板粘附率（Pad）、血栓长度（EL）、血栓湿重（EMW）及血栓于重（EDW）治疗后均有明显的降低（P <0.05），其中ηb、EPT、EL及 EMW指标基本恢复正常。茶色素能显著降低高脂动物血清中甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL），提高血清中高密度脂蛋白（HDL）。原征彦等发现茶中茶黄素（包括TF1、TF - 3- G、TF - 3'- G、TF - 3，3’- DG）对ACE酶（血管紧张素Ⅰ转换酶）具有显著抑制效应，具有降压的效果。Hara Y.等也发现茶黄素对ACE具有抑制作用，但对CPA（羧肽酶）的抑制作用弱；并木和子研究TF：（即TF -3 - G和TF - 3'- G）具有很强的抑制血小板凝集的作用。近阶段研究已表明，茶色素具有降液粘滞度的功效，可以预防和治疗心血管疾病，高脂血症、脂代谢紊乱、脑梗塞等疾病，改善微循环及血流变性等功效。

4. 抗氧化作用

茶叶具有抗氧化作用早在八十年代就已被人们认识和研究，但多集中于绿茶、绿茶提取物、茶多酚和儿茶素，九十年代中期开始茶黄素及红茶抗氧化研究。谢笔钧等进行了绿茶、乌龙茶、红茶及其内含主要组分抑制脂肪氧合酶活性及抗油脂氧化研究，结果表明：绿茶、乌龙茶和红茶的乙酸乙酯、正丁醇及水溶组分均具有强的抗氧化能力，其中以乙酸乙酯组分活性最强，儿茶素以EGCG抗氧化活性最强；其延缓猪油自动氧化期诱导为55.5小时，抑制5 - 大豆脂肪氧合酶活性的IC50值为10.0 mol·mL-1；茶黄素中TF – 3’- G和TF - 3，3’- DG抑制5 - 大豆脂肪氧合酶活性更强，其IC50值分别为0.57和0.23 mol·mL-1。Vinson J．A．等和Miller N．J．等分别进行了茶水提取物体外抑制血浆低密度脂质蛋白氧化研究，发现绿茶和红茶水提物均具有抗氧化活性，且绿茶比红茶抗氧化活性强。但Hodgson J．M．等进行绿茶和红茶提取物体外对诱导人血浆脂质蛋白氧化抗氧化效果比较，结果表明：绿茶和红茶提取物均具有抗氧化活性，且抗氧化不存在差异。Dong Z.等用绿茶和红茶及水提物分别饲喂12个月Sprague-Dawley鼠，发现绿茶和红茶以及它们的水提物均使血中葡萄糖明显降低，其中绿茶及水提物平均降低23.9％，红茶及水提物减少22.8％；血中三酸甘油脂也显著减少，其中绿茶及水提物减少33.3％，红茶及水提物下降25.0％。同时，SOD的活性分别提高了117.0％（红茶）和90.8％（绿茶），然而，丙二醛（Malondialdehyde）也分别提高了34.6％和25.4％。Yoshino K．等应用纯化的茶黄素和茶红素对叔丁基过氧化氢（tert-butyl-hydroperoxide）诱导鼠肝匀浆脂质过氧化进行抗氧化活性研究。结果显示TF1、TF – 3 - G和TRs抑制脂质氧化达50％（IC50）的浓度4.88×10-4％、4.09×10-4％和4.95×10-4％（W／V），其抗氧化活性比谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（L（+）一ascorbicacid）、生育醇（dl—alpha—tocpherd）、二丁基羟基甲苯（Butylatedhydroxytolucne，BHT）、丁基大茴香醚（Butylhy—droxyanisole，BHA）强，但比ECG、EGC和EGCG弱。Yoshida H．等用茶类黄酮化合物处理鼠巨噬细胞或人内表皮细胞研究细胞低密度脂蛋白氧化能力，结果显示：抑制细胞低密度脂蛋白氧化能力的顺序是TF - 3，3’- DG> TF1> EGCG> EGC> GA（Gallic acid没食子酸）；TF - 3，3’- DG抑制巨噬细胞低密度脂蛋白氧化的机理是降低了巨噬细胞过氧化物的产生，并显著的络合铁离子的缘固。

5. 抗癌作用

茶叶具有防癌、抗癌作用，给人类健康带来了福音。研究已发现茶叶不仅茶多酚具有防癌抗癌作用，茶黄素也具有很强的抗癌作用。1984年日本学者奥田拓男等较系统的研究了茶单宁、药材单宁、绿茶、红茶和乌龙茶、乙酸乙酯浸出物及红茶正丁醇和水浸出物的抗诱变作用，结果显示：三种茶的8种浸出物都对TrP-I（动物蛋白化焦后的诱变成分）显示出抗诱变作用，且随浓度增加抗诱变功效增加；对N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG），除绿茶乙酸乙酯浸出物和红茶水浸出物外，其它浸出物均显抗诱变作用。Morse M．A．等研究TFs和EGCG对N-硝基化甲基苯甲胺（NMBA）诱导鼠食道癌的影响，发现TFs和EGCG浓度在360—1200 mg·L-1可明显减少其食道癌的形成。Yang—GuangYus圳发现T 可抑制NNK[4-（methyl nitrosamino）-1-（3-pyridy）-1-butanone]诱导的A／J鼠的肺癌。王岳飞等I利用荧光溴化乙啶研究茶与DNA的相互作用，结果表明：各种茶类的茶液对EB-DNA荧光强度均有压低作用，不同茶类影响状况不同，压低作用同这些茶类所含的茶多酚量密切相关，但红茶的作用强于绿茶。Chung J．Y．等用纯化的绿茶和红茶多酚组分比较抑制H-ras-transformed细胞的Ras信号路径的能力，结果发现除EC外，所有茶多酚组分（绿茶的EGCG、EGC、ECG及异构体，红茶的TF1、TF - 3- G、TF - 3’- G、TF - 3，3’- DG）均对30.7bRas12细胞生长和AP-1（Activator Portein1）具有强烈的抑制。添加过氧化氢酶于EGCG或TF - 3，3’- DG培养的细胞不能阻止对AP - 1的抑制效果；EGCG和TF - 3，3’- DG抑制P44／22（胞外的Signal—regulated kinase 1和2）和没有影响Phosphorylat-ed-c-jun-NH2-terminal kinase的c-jun磷酸化作用。TF - 3，3’- DG抑制P38的磷酸化作用，而ECG不能，EGCE降低c-jun的水平、TF - 3，3’- DG则降低Fra-1的水平。

从已有的研究可以看出，茶色素茶黄素抗癌作用主要是通过：1）抑制致癌物诱发癌的形成；2）抑制癌细胞信号传输和增殖；3）抗肿瘤转移；4）诱导肿瘤细胞凋亡等。而产生药理作用的。[2]

4、茶黄色素的检测方法

茶黄素是一类具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称，因其分子式、相对分子质量各不相同，因此很难测定茶黄素的各个组分，同时，茶黄素又很难与茶红素及其它物质完全分离。以下对茶黄素测定方法进行了概述。

1. Roberts法

Roberts法是根据茶黄素和一部分茶红素（TRs I型）溶解于乙酸乙酯或4-甲基-戊酮（IB-MK），这部分可利用其能溶于碳酸氢钠溶液而分离，茶红素（TRs II型）留在水层。

该方法存在重复性差、测定含量值偏低的缺点，但其方法简单、试剂价格便宜且同时测定茶红素的含量，因此被广泛采用。

2. a-氨基乙基二苯酸酯（Favognost）试剂分析法

Hiton提出的一种快速测定方法。根据茶黄素分子中的苯并卓酚酮核可以与Flavognost试剂产生特异性反应，产生绿色络合物，测定其吸光值换算成茶黄素含量。

与Roberts法相比，该方法具有较好的重现性，已被Ellis推荐为国际红茶最低质量标准的检测方法。但该法受到提取液、提取温度、水的pH值等因素的影响，Flavognost试剂仅与茶黄素顺式上的两个羟基结合，使测定结果偏低，同时Flavognost试剂不易购得。

3. 氯化铝比色法

Likoleche-Nkhoma J W 等用AlCl3代替Flavognost试剂，铝盐与茶黄素复合产生红色，于波长525nm具有最大吸收，根据吸光值折算成茶黄素含量。

该方法的测定值与Flavognost方法测定结构没有显著差异，且铝盐的价格较便宜，但样品中加入过量的铝盐会产生浑浊。

4. SephadexLH-20柱层析（Column Chromatog-raphy，CC）法

此方法是竹尾忠一提出的。该方法能有双地分离茶黄素，而且对茶黄素的主要组分能定量，但操作复杂。

5. Whitehead法

Whitehead D L 等利用色素极性大小差异，提出的一种快速测定茶黄素总量的方法，该方法适于实验室和工厂的常规检测，但测量值偏高。

6. 高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）

Bailey R G等使用光电二级管列检测器的反相HPLC研究红茶溶出物的性质，4种茶黄素能够得到分离纯化，提出了HPLC法测定茶黄素主要组分及其它物质的方法。HPLC法更精确，并能使各茶黄素单体得到较理想的分离。但该法需要高纯度的茶黄素标样。

7. 毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis，CE）

Bee B L 等首次采用毛细管电泳测定儿茶素类化合物和茶黄素类化合物。Wright L P 等用非水相毛细管电泳测定红茶中的4种主要茶黄素，并对有机溶剂的组成和电解质浓度对分离效果的影响进行了研究，确定了最佳的分离溶剂组版为V（乙腈）：V（甲醇）：V（乙酸）=71：25：4和90 mmol/L的醋酸铵，10min内实现了茶黄素的基线分离，与常规毛细管电泳相比具有显著的优势。

8. 高速逆流色谱法（High Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC）

高速逆流色谱法可避免样品与固体载体的化学反应和死吸附等缺点，每次分离样品结束后，管道中的残留溶剂均可以冲出，不会对后续分离产生任何影响，因此高速逆流色谱法分离样品具有高的回收率。[3]

总之，茶黄素的分析测定方法各有利弊，可以根据具体情况选择一种切实可行的分析方法。

5、结语

近年来，随着对茶叶中茶黄素的研究不断深入，人们对其功能性质和生理活性有了更多的了解，茶黄素在药品、食品和化妆品等领域的应用越来越广泛，具有很好的市场前景。茶黄素作为茶叶中的一种重要成分，如何在低成本上提高茶黄素的产率和纯度仍是茶黄素研究中的主要问题。随着多酚氧化酶酶催化反应的研究，酶催化合成茶黄素将是未来研究的热点。在茶黄素药理学活性研究的基础上，用茶黄素或其衍生物生产天然高效的药品也将是今后研究的重点。

参考文献：

[1] 丁其欢,等.茶黄素的理化性质·提取分离及生物活性研究进展[J].安徽农业科学,2017,45(11):85-87,113.

[2] 李立祥,萧伟祥.茶色素及茶黄素药理作用研究进展[J].福建茶叶.2002,4,35-38.

[3] 王洪新,等.茶黄素的制备、分析、分离及功能活性研究进展[J].食品与生物技术学报.2011,30(1):12-19.

附件：

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