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Tim4@ILI-01免疫亲和材料用于外泌体的分离富集

  • 小矮马
    2021/08/01
    小矮马
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分离/萃取

  • Tim4@ILI-01免疫亲和材料用于外体的分离富集

    引言



    体作为重要的信息载体,参与肿瘤的发生、进展、转移和化疗耐药等过程,近年来受到人们的广泛关注。外体携带大量的遗传物质,已成为液体活检最理想的分析目标。外体也是目前最有前途的非侵入性诊断和预后的生物标志物之一。为了进一步提高外体的临床应用价值,开发高效的分离技术具有重要的意义。目前,UC是外体分离的金标准。然而,这种方法需要繁琐的过程,并且具有耗时长(> 10 h),捕获效率低(5%至25%)和重现性差的缺点。基于聚合物的外体分离试剂盒是通过添加聚合沉淀物以获得大量外体的方法。尽管该方法快速简便,但其他非外体污染物也可能共沉淀。因此,捕获的外体纯度相对较低。基于微流体的分离技术是利用外体的固有特征来捕获外体。但是,该技术不仅需要大量的临床样本,而且处理能力低也会影响后续的下游分析。最近,开发了一种基于抗体的亲和技术以提高外体的富集效率。例如,Boriachek等人设计了一种使用CD63抗体功能化的载金氧化铁纳米颗粒(Au-NP Fe2O3NC)用于分离和检测外体。将Au-NP Fe2O3NC材料分离得到的外体进一步识别胎盘碱性磷酸酶(PLAP)修饰的丝网印刷电极后,可以特异性检测出胎盘细胞分泌的外体。该方法可用于检测各种临床疾病的特定外体群体,尤其是妊娠并发症。然而,这些方法难以同时实现外体的高效捕获和无损释放,这极大地限制了外体生物学功能研究和在临床诊断中的应用。

    为了实现外体的临床价值,开发一种快速,有效且无损的外体分离方法具有重要的意义。金属有机框架材料作为一种特殊的多孔材料,因其具有高比表面积、良好的稳定性、较低的密度以及可调节的表面性能而引起人们的广泛关注。而基于抗体的免疫亲和捕获法具有灵敏度高、特异性好、且分离效率高等特点,在外体的分离富集方面具有很好的应用前景。将两者结合制备一种新的分离方法,实现外体的捕获和无损释放,为外体的下游临床诊断和检测提供强大的技术支持。

    原理



    研究设计合成了一种Tim4@ILI-01免疫亲和材料用于分离富集外体。该分离方法具有处理时间短、非特异性粘附率低、捕获效率高以及无损释放外体等基本特征。如图所示,首先利用阳离子ILI作为有机配体,制备强亲水性的ILI-01 MOFs片作为捕获外体的基质材料。ILI-01 MOFs材料固有的亲水性能有效降低外体分离过程中的非特异性细胞粘附。此外,由于ILI-01 MOFs薄片上富含羧基,可以提高亲和力抗体的后续偶联效率,从而大大提高外体的捕获效率。在此,我们选择了针对外体膜上磷脂酰丝氨酸(PS)受体的新型Tim4抗体。已经证明Tim4蛋白分子与PS分子之间的特定相互作用可以有效地将外体从样品中分离出来,并且两者的结合存在Ca2+依赖特性,在中性条件下通过添加螯合剂可以轻易洗脱和回收外体。因此,开发的Tim4@ILI-01免疫亲和材料可以实现无损捕获和释放完整的外体,为后续临床诊断和治疗奠定了坚实的基础。

    1 Tim4@ILI-01免疫亲和薄片



    与常规外体分离方法的比较

    进一步将所制备的Tim4@ILI-01免疫亲和材料与金标准“UC”进行比较。如2所示,UC分离到的外体的大小分布明显更宽Tim4@ILI-01免疫亲和材料捕获的外体显示出窄的大小分布。此外,通过Tim4@ILI-01免疫亲和材料捕获的外体的众数和平均大小均明显小于UC捕获的外体。进一步比较了两种方法的捕获颗粒数和蛋白含量,Tim4@ILI-01免疫亲和材料富集法分离得到的颗粒数和蛋白含量分别比UC5.2倍和2.4之前的研究表明,颗粒-蛋白比与外体样品的纯度呈正相关Tim4@ILI-01免疫亲和材料捕获的外体颗粒-蛋白比值UC6.7倍。因此,基于Tim4@ILI-01免疫亲和材料的富集法可以产生更多纯度更高的外显示出明显的优势。

    2 比较Tim4@ILI-01免疫亲和材料和UC分离的外体:(AUC分离的外体大小分布;(B)众数和平均大小;(C)颗粒计数和总蛋白量;(D)颗粒数与总蛋白质量的比率



    进一步采用Western blotting对上述结果进行验证。如图3所示,通过Tim4@ILI-01免疫亲和材料富集的外体表面HSP70CD63TSG101CD81的蛋白量分别比UC富集的4.8倍、2.9倍、1.9倍、1.5。以上结果可表明所建立的基于Tim4@ILI-01免疫亲和材料富集法优于传统的UC

    3比较Tim4@ILI-01免疫亲和材料富集法和UC分离的外体:(A)外体标记蛋白的Western blotting结果;(B)蛋白质含量的比较

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