D-异抗坏血酸的相关讨论
李宇潇
摘要：D-异抗坏血酸，英文名称为D-Isoascorbic acid，中文别名为赤藻糖酸，CAS号为89-65-6，分子式为C7H10O6，为白色有光泽的颗粒结晶，易溶于水、乙醇和吡啶，可溶于丙酮，微溶于甘油，不溶于乙醚和苯。其在自然界中并未发现天然存在，多以玉米淀粉为原料，通过发酵成葡萄糖酸来制得。作为食品抗氧化剂、防腐剂和发色助剂，D-异抗坏血酸主要用于食品工业和医药工业。我国尚未发布明确的食品中D-异抗坏血酸国家标准，但有些地方标准可供检验时进行参考。
关键词：D-异抗坏血酸 理化性质 检测方法 检出限 标准
D- 异抗坏血酸（D-Isoascorbic acid；D-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯；EA），亦称赤藻糖酸、异维生素C，分子式C6H8O6，分子量为176.13。是维生素C（抗坏血酸，VC）的一种光学异构体，与VC有着相似的化学性质，有强的还原作用。关于生理效果，EA的抗坏血病作用只是VC的1/20，但是血压、利尿、解毒、肝脏糖原的生成和促进色素排泄的作用与vC几乎相同。
1. 
理化性质
1.1外观
D-异抗坏血酸为白色至浅黄色结晶性粉末或颗粒，无臭，味酸，干燥状态下在空气中相当稳定，但在溶液中遇空气则迅速变质。
1.2.结构
D-异抗坏血酸是维生素C的光学异构体，其分子结构如图1所示
1.3.溶解性
D-异抗坏血酸是一种水溶性的化合物，极易溶于水（40g/100mL），可溶于乙醇（5g/100mL），难溶于甘油，不溶于乙醚和苯。0.1%水溶液的pH值为3.50，而1%水溶液的pH值为2.80。
1.4.稳定性
D-异抗坏血酸熔点166-172℃，并分解；遇光逐渐变黑，重金属离子会促进其分解。化学性质类似于抗坏血酸，但几乎无抗坏血酸的生理活性作用(仅约1/20)。抗氧化性较抗坏血酸佳，价格亦较廉，但耐热性差。D-异抗坏血酸有强还原性，遇光则缓慢着色并分解，重金属离子会促进其分解。
1.5.与机体作用
对D-异抗坏血酸（EA）进行的毒理学实验表明，当摄入量达到1g/kg体重时，EA(EN)对啮齿动物没有胚胎毒性和致畸性:鸡胚胎实验不能证明EA(EN)对人有潜在的致畸性和胚胎毒性:长期毒性和致癌性研究实验显示，EA(EN)没有任何明确的毒性或致癌作用；EA比VC难吸收，在组织中难储存，在肾中难以再吸收，且很快排泄；在EA数量高于VC很多时，才会明显干涉组织中VC的吸收和储存；在高剂量的EA(EN)消耗期过后，人体对VC的吸收与摄入高剂量EA(EN)前相比没有变化。
2. 制法
因D-异抗坏血酸尚未发现其在自然界中有分布，故市场销售的异抗坏血酸均为人工合成。
D-异抗坏血酸的生产方法主要有间接发酵、酶法、基因工程法、间接发酵法、直接发酵法四种。
2.1直接发酵法
通过在发酵培养基中接种真菌，可直接生产D-异抗坏血酸，能直接产生D-异抗坏血酸的菌种主要为青霉菌。直接发酵法的生产代谢途径包含两步：一是葡萄糖被葡萄糖氧化酶催化氧化成D-1，5葡萄糖酸内酯，D-1，5-葡萄糖酸内酯同时会转化成D-1，4-葡萄糖酸内酯，这是一步可逆反应，由于D-1，5-葡萄糖酸内酯在中性条件下不稳定，会水解成葡萄糖酸；二是葡萄糖酸内酯在葡萄糖酸内酯氧化酶的作用下，转变成D-异抗坏血酸，同时在转化的过程中有个未知的含有1，5内酯环的中间产物生成。
2.2间接发酵法
国内外D-异抗坏血酸的生产普遍采用的是间接发酵法。间接发酵法生产D-异抗坏血酸是采用发酵与与合成相结合的方法。首先利用细菌将葡萄糖转化为2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KGA），再以2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KGA）或者2-酮基-D-葡萄糖酸钙（2-KGCa）为起始原料经酯化、酸化等工艺合成D-异抗坏血酸。
2.3酶法
酶法是指在一定的温度和酸度下，内酯酶（如葡萄糖酸内酯酶、内酯脱氢酶等）可以将溶液中的2-KGA转化为D-异抗坏血酸。采用酶法生产异抗坏血酸，尽管酶具有高效性和专一性，没有底物的反馈抑制作用，反应步骤简单，但是葡萄糖酸内酯酶比较难得，酶的活性及其性质也并不清楚，酶的比率难以确定，且产率太低，工业应用价值很低。
2.4基因工程法
基因工程法是将青霉中的糖内酯氧化酶的基因克隆到酵母中，并在酵母中表达，由此通过酵母来发酵生产D-异抗坏血酸。基因工程法虽然其产量还达不到工业化生产的要求，但是相对于酶法其产量大幅提高，且克服了铁离子对青霉抑制作用这一难题，为异抗坏血酸的直接发酵的工业化做出了重要的一步。
3.用途
EA及其钠盐——D-异抗坏血酸钠(sodium erythorbate,EN)的用途十分广泛，主要用作食品的抗氧化剂；护色剂--根据食品的种类，选用D-异抗坏血酸或其钠盐。D-异抗坏血酸可以防止肉类制品、鱼肉制品、鲸肉制品、鱼贝腌制品、鱼贝冷冻品等的变质，或与亚硝酸盐、硝酸盐合用提高肉类制品的发色效果（如pH在6.3以上，则与柠檬酸、乳酸等合用）。【2】EA在其他方面的用途归纳起来有:作为药品、药品或卫生用品的辅助材料；作为化工原料的稳定剂；作为除氧、抗蚀、除垢溶剂的重要组分；作为油田地层酸化处理的化学添加剂；作为电解、电镀中的电解质；用于金属微粉的生产和贵重金属的回收:用于一些高分子聚合物的制取；作为影像记录材料的生产原料。此外，EN在纺织、建材、军工和日用化工等方面也有应用[3]
4.检验方法
4.1质量检验[4]
根据GB1886.49-2016《国家食品安全标准 D-异抗坏血酸》，以葡萄糖为原料,经发酵制得⒉-酮基-D-葡萄糖酸,再经酯化,转化,酸化.精制等步骤生产的食品添加剂D-异抗坏血的质量检测方法如下：
4.1.1鉴别试验
4.1.1.1试剂和材料
亚硝基铁氰化钠指示液；氢氧化钠溶液:4 gL；三氯乙酸溶液；1十20.活性炭；吡咯.
4.1.1.2鉴别方法
取2 mL.试样的水溶液(1十50),加几滴亚硝基铁氰化钠指示液,再加1 mL氢氧化钠溶液,溶液立即显瞬间蓝色.
称取约15 mg试样溶于15 mL三氯乙酸溶液中,加入约200 mg 活性炭﹐强力摇动混合物1 min,经带有槽纹的小过滤器过滤,如有必要再次过滤,以获得澄清滤液。取5 mL,清液,滴加1滴吡咯,摇动混合液,直至吡咯溶解,然后于50℃水浴加热,溶液显蓝色。
按GB/T 617规定的方法测定,样品熔点范围为164 ℃~172 ℃(分解)。
4.1.2D-异抗坏血酸含量(以干基计)的测定
4.1.2.1试剂和材料
碘标准滴定溶液:c(,I,)-o.1 mol/L.硫酸溶液:100 g/L.淀粉指示剂:10 g/L.
4.1.2.2分析步骤
准确称取约0.4 g(精确至0.000 1 g)干燥后的试样,置于250 mL碘量瓶中,加入100 mL.新蒸的冷蒸馏水和25 mL硫酸溶液。待试样溶解后,立即用碘标准滴定溶液滴定。接近滴定终点时,加入 1 mL淀粉指示剂,继续滴定至溶液呈蓝色并在30 s内不褪色,记录滴定试样溶液所消耗的碘标准滴定溶液的毫升数.
4.1.2.3结果计算
D-异抗坏血酸含量(以干基计)的质量分数rw ,按下式计算:
式中:
c1——碘标准滴定溶液的浓度,单位为摩尔每升(mol/L);v,——试样消耗碘标准滴定溶液的体积,单位为毫升(mL) ;
8.806——1 mL的 0.1 mol/L碘标准滴定溶液相当于8.806 mg的异抗坏血酸;
m1——试样的质量,单位为克(g);
100 ——换算系数。
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于0.2%.
4.1.3比旋光度的测定
4.1.3.1仪器和设备
旋光仪:精度为士0.01°.
4.1.3.2分析步骤
称取5 g试样(精确至0.0001 g),置于50 mL容量瓶中,加入蒸馏水溶解并稀释至刻度﹐摇匀。在25 ℃士1℃条件下用旋光仪测量比旋光度.
4.1.3.3结果计算
比旋光度[a]25D﹐按下式计算:
式中：
α———25℃时试样的旋光度,单位为度(°）;
ρ2——试样的质量浓度,单位为克每毫升(g/mL);
L——旋光管的长度,单位为分米(dm)。
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于0.3°。
4.1.4干燥减量的测定
4.1.4.1仪器和设备
通常试验室用仪器，称量瓶:直径50 mm,高30 mm，真空干燥箱。
4.1.4.2分析步骤
准确称取约5 g试样(精确至0.000 1 g),置于已干燥至恒重的称量瓶中,在60 ℃±1 ℃,0.01 MPa下干燥至恒重,然后置于干燥器中冷却至室温,称量。
A.5.3―结果计算
干燥减量的质量分数w ,按下式计算:
式中;
m2———称量瓶和试样干燥前的质量,单位为克(g﹔
m3——称量瓶和试样干燥后的质量,单位为克(g>;
m4——称量瓶的质量,单位为克(g)。
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于0.05%。
4.1.5灼烧残渣的测定
4.1.5.1仪器和设备
瓷坩埚，高温炉
4.1.5.2分析步骤
称取约l g试样(精确至0.000 1 g),置于已在600 ℃~700 ℃下灼烧至恒重的绀w中,在电炉上缓慢加热至试样完全碳化。将碳化的试样冷却,用0.5 mL的硫酸润湿残渣,继续加热至硫酸蒸气逸尽，并在600 ℃~70o ℃下灼烧至恒重。
4.1.5.3结果计算
灼烧残渣的质量分数ws ,按式(A.4)计算:
式中：
m5———坩埚和灼烧残渣的质量,单位为克(g）
m6——坩埚的质量,单位为克(g）;
m7——坩埚和试样的质量,单位为克(g）。
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于0.05%。
4.1.6技术要求
4.1.6.1感官要求
4.1.6.2理化指标
项目 | 指标 | 检验方法 |
D-异抗坏血酸含量(以干基计)ω/% | 99.0~100.5 |
4.1.2 |
比旋光度[a]25D | -16.5°~-18° |
4.1.3 |
干燥减量，ω/% | 0.4 |
4.1.4 |
灼烧残渣，ω/% | 0.3 |
4.1.5 |
砷（As）/（mg/kg） | 2.0 |
GB5009.76 |
铅（Pb）/（mg/kg） | 2.0 |
GB5009.75 |
4.2限量检测[5]
我国尚未制定相关的国家级标准，因此采用DBS22001-2012《吉林省地方标准 食品中D-异抗坏血酸的测定 高效色谱法》进行测定
4.2.1原理
试样中D-异抗坏血酸用溶剂提取、稀释后，经液相色谱法亲水作用色谱（HILIC色谱）柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
4.2.2试剂和材料
除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为一级水，符合GB/T 6682中用水规定。
D-异抗坏血酸，CAS 号：89-65-6，(含量>99.7 %)。
乙腈（色谱纯）。
乙腈。
磷酸。
0.1 %磷酸水溶液：吸取磷酸 1mL，加一级水定容至 1000mL。
流动相：精密吸取 0.1 %磷酸水溶液 100mL，加色谱纯乙腈定容至 1000mL。
D-异抗坏血酸标准溶液的制备（应现配现用）：精密称取 D-异抗坏血酸标准品 100mg 于 100mL 棕色容量瓶中，加 0.1 %磷酸水溶液定容至刻度，得 D-异抗坏血酸浓度为 1mg/mL 的标准溶液；精密吸取 D-异抗坏血酸标准溶液 1mL、2mL、5mL、10mL、20mL 于 100mL 棕色容量瓶中，加流动相稀释并定容至刻度，得浓度为 10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL 的 D-异抗坏血酸的系列标准溶液。取此系列标准溶液适量，用 0.45μm 一次性微孔滤膜过滤至 2mL 进样瓶中，待测。
4.2.3仪器和设备
液相色谱仪：配紫外检测器。
亲水作用（HILIC）色谱柱：250mm×4.6mm，5μm，10nm 或性能相当的其他型号色谱柱。
电子分析天平：感量 0.1 mg。
匀浆机。
离心机，50mL，4000r/min。
超声波清洗器。
0.45 μm 一次性微孔滤膜，水相。
1
0.45 μm 一次性微孔滤膜，有机相。
4.2.4样品处理
4.2.4.1条件
检验过程应在避光条件下快速进行。
4.2.4.2液体试样
准确称取试样5 g，精确至0.001 g，置于50 mL容量瓶中，加流动相适量，混匀后，加流动相定容至刻度。充分振荡混匀后，取此试样溶液适量，用0.45 μm一次性微孔滤膜过滤至2 mL进样瓶中，待测。含二氧化碳气体的汽水、可乐等饮料样品需先超声振荡5 min，驱除气体后再取样、测定。
4.2.4.3水溶性固体试样
准确称取试样5 g，精确至0.001 g，置于50 mL容量瓶中，加适量0.1 %磷酸水溶液至试样溶解，充分振荡，加流动相定容至刻度。此试样溶液充分振荡混匀后，用0.45 μm一次性微孔滤膜过滤至2 mL进样瓶中，待测。
4.2.4.4蔬菜、水果及其罐头制品
取有代表性的部分匀浆后，称取试样12.5 g，精确至0.001 g，置于250 mL锥形瓶中，加15 mL0.1 % 磷酸水溶液，超声振荡提取5 min，转移全部提取液至50 mL离心管中，4000 r/min下离心10 min。离心后的上清液转移至50 mL容量瓶中，用约20 mL0.1 %磷酸水溶液分2次清洗沉淀，收集上清液至同一50 mL容量瓶，加流动相定容至刻度。此试样溶液充分振荡混匀后，用0.45 μm一次性微孔滤膜过滤至2 mL 进样瓶中，待测。
4.2.4.5水不溶性固体试样
准确称取试样12.5 g，精确至0.001 g，置于250 mL锥形瓶中，精确加入0.1 %磷酸水溶液50 mL，匀浆后，在4000 r/min下离心10 min。取上清液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加流动相定容至刻度。此试样溶液充分振荡混匀后，用0.45 μm一次性微孔滤膜过滤至2 mL进样瓶中，待测。
4.2.5测定
4.2.5.1测定方法
精密吸取试样和标准品溶液，按规定色谱条件分别进样20 μL，记录色谱图。以D-异抗坏血酸保留时间定性，外标法峰面积定量。
4.2.5.2高效液相色谱参考条件
亲水作用（HILIC）色谱柱：250×4.6mm，5μm，或性能相当的其他型号色谱柱； 检测波长：245 nm；
流动相：0.1 %磷酸溶液+乙腈=10+90； 流速：1.0 mL/min；
进样体积：20 μL； 柱温：40 ℃。
4.2.6结果计算
结果按下式进行计算：
式中：
X——试样中D-异抗坏血酸含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
C——从色谱工作站中读出试液中D-异抗坏血酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V——试样定容体积，单位为毫升（mL）。
F——试样的稀释倍数；
m——试样质量，单位为克（g）；
结果保留3位有效数字。
4.2.7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。
5.讨论
E- 异抗坏血酸是一种价格低廉且暂未证明有毒害的抗氧化剂与起色剂，在食品添加剂中有很广阔的利用前景。但仍不应过量使用，国家应完善出台相关标准，规范其检测方法与用法用量。
参考文献
[1] 周强,魏转,孙文敬,余泗莲,李中兵.D-异抗坏血酸生产技术研究进展[J].食品科学,2008(08):647-651.
[2] 刘明霞,周强,陈卫年.D-异抗坏血酸的生产应用现状及前景,食品工业科技.2013,2:376-381
[3] 阮健余.D-异抗坏血酸的应用途径(J)．中外技术情报，1991(8): 1-3.
[4] GB1886.49-2016《国家食品安全标准 D-异抗坏血酸》
[5] DBS22001-2012《吉林省地方标准 食品中D-异抗坏血酸的测定 高效色谱法》
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