【求助】微生物方法学验证薄膜过滤法

你们有<中国药品检验标准操作规范>2005年版吗?上面说的比较清楚。要用到6种（药典规定）规范上用了7种菌。包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。
我们原来也用中国药典的方法，现在改用欧洲药典的方法了。

我知道要做的几种菌 但是怎么具体操作呢? 不过还是谢谢哦

这是我们的方法
1.菌液制备
取已活化的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉，用0.9%无菌氯化钠溶液洗下菌苔（生孢梭菌直接稀释），吸入样品比浊管内，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释适宜浓度制成均匀菌液，再将菌液稀释至与细菌标准比浊管相同浓度，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100CFU的菌悬液（可用生物显微镜计数）。在试验的同时各取1ml稀释好的金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌，白色念珠菌，黑曲霉菌液涂布营养琼脂平板（金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌30-35℃培养3天，白色念珠菌，黑曲霉20-25℃培养5天后计数）。
2.灵敏度抑制试验步骤
取X支供试品(按你们的检量,我们的是安瓿瓶小容量,所以要加生理盐水)，加入适量0.9%无菌氯化钠溶液，混匀，各取(用几个滤筒就取几分之几)与1ml含菌量少于100CFU的的菌液(所有菌)混匀,按薄膜过滤法过滤至一次性使用全封闭集菌培养器内，再将硫乙醇酸盐流体培养基加至滤有金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌培养器内,改良马丁培养基加至滤有白色念珠菌、黑曲霉的培养器内.另取一套全封闭集菌培养器，不加供试品，其他操作同上，作为阳性对照；再取一套全封闭集菌培养器，只过滤生理盐水、不加菌，加入培养基后作为阴性对照,含有生孢梭菌供试品阳性、阳性对照，阴性对照的硫乙醇酸盐液体培养基放置30-35℃，培养3天.装有金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌、阴性对照、阳性对照的硫乙醇酸盐流体培养基放置20-25℃培养3天.所有改良马丁培养基置20-25℃培养5天.每天进行观察并记录结果。重复以上试验三次，并记录各次结果.(实验顺序:阴性-阳性对照/供试品+菌,先做阴性避免染菌,出现假阳性)
3.标准:在三次的试验中，阳性对照应生长良好，阴性对照应不长菌；与阳性对照管比较，若供试品阳性各容器中的试验菌均与相应的阳性对照一样生长良好，则验证合格并可照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品阳性的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量有抑菌作用，验证不合格。验证不合格后应调整方法，重新验证。

如果你还要再详细的操作步骤再说,我们有一篇专门的无菌检查(薄膜过滤法)操作SOP.

先谢谢了哦　　可是这种方法要怎么计数呢．．只能通过肉眼观察吗？薄膜过滤法的滤膜应该要在有培养基的平皿里培养吧

你是贴膜培养的啊?
那这种方法就不一定适用了.这是用于无菌检查的方法验证,主要是看样品有没有抑菌性.我们用的是一次性集菌器,把液体培养基灌进去直接培养的.
你可以尝试下用反复使用的集菌器,这样把滤膜取出贴膜培养,平行做菌液涂布平板计数.这方法我上面提了,就是用1ml涂布琼脂平板.

如果你还要再详细的操作步骤再说,我们有一篇专门的无菌检查(薄膜过滤法)操作SOP.
专门的无菌检查(薄膜过滤法)操作SOP.能麻烦你写给我一下吗？（search20002003@yahoo.com.cn) 万分感谢！

可要好好学习一下

謝謝各位大大精闢的解說