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液相色谱-质谱联用仪测定蔬菜中氨基甲酸酯类农药及其代谢物研究

wsz29

2022/09/01
安阳疾控理检队

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液质联用（LCMS）

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液相色谱-质谱联用仪测定蔬菜中氨基甲酸酯类

农药及其代谢物研究

引言：氨基甲酸酯类农药(N-methylcarhamates, NMCs)是一种高效广谱杀虫剂，主要有涕灭威砜、涕灭威亚砜、灭多威、3-羟基克百威、涕灭威、克百威、甲萘威、异丙威、抗蚜威、速灭威、残杀威、甲硫威、苯氧威13种氨基甲酸酯类农药及其代谢物，具有杀灭效果强、分解代谢快、残留期短、高效、选择性强等特点^[1]，克服了有机氯农药的高残留和有机磷农药耐药性的缺点，在农业生产上作为杀虫剂、除草剂、杀菌剂广泛施用^[²^] ，氨基甲酸酯作为杀虫剂的毒性机理是可抑制昆虫乙酰胆碱酶(Ache)和羧酸酯酶的活性，造成乙酰胆碱(Ach)和羧酸酯的积累，影响昆虫正常的神经传导而致死^[2]。随着有机氯和有机磷类农药的禁用或限用，氨基甲酸酯类农药使用范围和用量逐年增加^[3]，违规使用往往导致残留超标，对食品、环境以及水的污染已不可忽视，目前对于氨基甲酸醋类农药的检测方法很多，有酶联免疫吸附法^[4]，液相色谱柱后衍生荧光法^[5] ，气相色谱质谱法（GC/MS）^[6]，液相色谱串联质谱法^[7]，其中，酶联免疫吸附法该法灵敏度低无法满足当今社会的严格要求。液相色谱柱后衍生荧光法尽管应用最广泛，灵敏度高，但是柱后衍生过程繁琐，特异性不强，干扰严重；气相色谱质谱法（GC/MS）由于具有高选择性、易于操作且一次分析可以鉴定多种农药等优点，广泛应用于农药分析，然而，如果样品不进行衍生化处理，GC/MS 很难分析极性、热不稳定或低挥发性的化合物，由于部分氨基甲酸醋类农药的热稳定性较差，采用气相色谱法测定会造成分解，如涕灭威、甲萘威等，使得测定不准确；液相色谱串联质谱法是近年来发展起来的一种方法，可以在一次分析中定量和鉴定几百种目标化合物^[8]，具有很高的选择性和灵敏度，但对于蔬菜中涕灭威砜、涕灭威亚砜、3-羟基克百威、涕灭威、克百威5种氨基甲酸酯类农药的同时测定的方法目前还未见报道，本报告参考相关报道，结合本实验仪器和样品，研究确定了使用乙腈直接提取，分散固相萃取（QuEChERS）净化，液相色谱-串联质谱法检测蔬菜中涕灭威砜、涕灭威亚砜、3-羟基克百威、涕灭威、克百威5种氨基甲酸酯类农药的方法，以保留时间和质谱特征碎片离子丰度比定性，外标法定量，应用该方法很好完成了本年度蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留检测任务，方法简便、准确、快捷、线性范围宽，灵敏度高和检测限低。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1样品来源

样品采集自市区超市及农贸市场，以绿叶蔬菜为主。

1.1.2 仪器

液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）（美国waters TQ-S）；电子天平（感量0.001g 赛多利斯BT-223S）；均质机（飞利浦 HR2850）；漩涡混匀器（SCILOGEX MX-S）；漩涡振荡器（德国 heidolph Multi Reax）；超声波清洗机（南京先欧仪器制造有限公司 XO-800DTN）；高速冷冻离心机（蜀科 TGL-16 ）；多功能净化柱：Mycosep^TM226多功能净化柱（ROMER）；Carb/NH2固相萃取小柱(中国天津博纳艾杰尔)；微孔滤膜（津腾，0.22μm，混合型）。

1.1.3试剂

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682规定的一级水。乙腈（美国默克公司优级纯）；甲酸（中国上海麦克林色谱纯）；无水硫酸钠（北京化工厂，分析纯）；氯化钠（北京化工厂，分析纯）；C18吸附剂（中国天津博纳艾杰尔）；N-丙基乙二胺（PSA）粉末（中国天津博纳艾杰尔）；农药标准品：涕灭威亚砜、涕灭威砜、3-羟基克百威、涕灭威、克百威（100.0μg/ml，农业部环境保护科研监测所）。

1.1.4 农药标准溶液配制：

农药标准储备液：将5种单个农药标准溶液(100.0μg/ml)，用甲醇溶解，逐一配制成10μg/ml的单一农药标准储备液，贮存在-20℃以下冰箱中。

农药混合标准储备溶液1μg/ml：逐一准确吸取一定体积的单个农药储备液于同一容量瓶中，用甲醇稀释至刻度配制成农药混合标准储备溶液，使用前用甲醇稀释至所需质量浓度。

1.2 方法

1.2.1试样制备

1.2.1.1取样

取蔬菜样品，取可食部分，经缩分后，将其切碎，充分混匀放入均质机粉碎，制成待测样，放入分装容器中，于-20℃条件下保存，待提取。

1.2.1.2 提取

准确称取10 g均质样品（精确至0.01 g）于 50ml离心管内，加入10 mL乙腈，混匀后漩涡振荡器提取20 min。加入8.0 g无水硫酸钠和2.0 g氯化钠，涡旋后，5000 rpm离心5 min，取上有机相于鸡心瓶中。用10 mL乙腈重复提取一次，合并上层有机相。

1.2.1.3 净化：

QuEChERS净化：从合并的有机相中取2 mL 加入0.25 g无水硫酸钠和0.4 g PSA粉末（对于脂肪含量较高的蔬菜品种如豆类等，再加入0.25 g C18吸附剂），涡旋后以5000 rpm离心2 min。取0.5 mL上清液加入0.5 mL 0.1%甲酸水溶液混匀，过0. 22 mm有机相滤膜后供LC-MS 分析。

1.2.2 仪器条件

1.2.2.1色谱条件见表1

表1 液相色谱条件

色谱柱	CAPCELL PAK C₁₈柱（CR-02, 5mm; 100′2.0 mm）
柱温	35°C
流速	0.3 mL/min
进样量	5 mL
样品池温度	15°C
流动相A 流动相B	乙腈 0.1%甲酸
梯度洗脱程序	见表2

表2 梯度洗脱表

时间（min）	流动相A（%）	流动相B（%）
0.00	5	95
3	25	75
6	95	5
7	95	5
11	5	95
12	5	95

1.2.2.2质谱条件见表3

表3 质谱条件

电离方式	ESI
扫描方式	正离子扫描
监测方式	多反应监测
电喷雾电压	3.5kV
离子源温度	150°C
脱溶剂其流量	700L/H
脱溶剂其温度	500°C
保留时间、监测离子对	见表4

表4 5种氨基甲酸酯保留时间及监测离子对

名称	保留时间 min	母离子 m/z	碰撞电压 V	锥孔电压 V	子离子 m/z
涕灭威亚砜	4.69	207.1	20	30	132.0*, 89.0
涕灭威砜	5.68	223.0	20	30	86.1*, 148.2
3-羟基克百威	8.03	238.3	20	30	163.2*, 181.0
涕灭威	9.45	208.1	25	35	89.2*, 116.2
克百威	10.19	222.1	35	35	165.5, 123.1*

注：带*为定量离子

1.2.3 标准曲线的绘制及试样的测定

吸取混合标准使用液10、20、50、100、200、500μL，加初始流动相（5%流动相A：95%流动相B）稀释定容至1ml，配制成系列标准溶液，浓度分别为：10、20、50、100、200、500 μg/L。分别将系列标准溶液和处理好的试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，记录总离子流图和质谱图及被测组分的峰面积。以系列标准溶液中目标化合物的浓度与相对应的峰面积绘制标准曲线，得到线性回归方程。

1.2.4 定性分析

在相同的试验条件下，以各化合物不同的特征碎片离子丰度及保留时间进行定性分析。要求所检测的化合物色谱峰信噪比（S/N）大于3；保留时间的偏差不大于5%；试样中被测组分的监测离子相对丰度与浓度相当的标准溶液的相对丰度一致，其偏差不超过表5的规定。

表5 定性离子相对丰度的最大允许偏差

相对离子丰度	>50%	>20%至50%	>10%至20%	≤10%
允许的相对偏差	±20%	±25%	±30%	±50%

1.2.5 定量分析

以标准系列溶液中被测组分的定量离子峰面积与目标物的浓度作图，绘制标准曲线。

试样中被测组分的含量按式（1）计算：

X= C′

（1）

式中：

X--试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（mg/kg）；

C--由标准曲线得到的试样提取液中被测组分质量，单位为纳克（ng）；

m--取样量，单位为克（g）；

f--试样稀释倍数。

计算结果保留三位有效数字。

2 结果与分析

2.1 样品前处理提取方式的选择

对加入100 mg/kg水平的混合标准溶液加标样品，分别采用漩涡振荡器提取20 min和超声提取20 min，各平行测定6份，计算平均加标回收率，涡旋振荡器提取平均回收率为83.2%

，超声提取平均回收率为73.2%，漩涡振荡器优于超声提取，故采用漩涡振荡器20 min进行提取。

2.2样品前处理净化方法的选择

由于氨基甲酸酯类化合物极性较高，易与样品基质中的高极性化合物在质谱电喷雾电离源处发生离子化抑制现象而导致回收率偏低^[9]。此外，如果样品不净化可能污染仪器和缩短色谱柱使用寿命，所以本试验从回收率对比SPE净化和改进QuEChERS净化两种方法，发现改进的 QuEChERS方法较为简单，且回收率理想；根据不同粉末对不同干扰物质的净化作用，以及不能对目标化合物进行吸附的原则，最终选用PSA400 mg，（对于脂肪含量较高的蔬菜品种如豆类等，再加入0.25 g C18吸附剂）作为净化粉末，去除样品基质中的杂质，净化效果好，回收率理想。

2.3 质谱方法的建立

高分辨质谱仪不需要对质谱条件进行特殊优化，使用仪器智能方法开发程序和方法库推荐条件，综合考虑灵敏度和仪器能承受的温度，离子源温度确定为150 ℃，其余离子条件为通用质谱条件，见 1.2.2.2，该条件下，5种氨基甲酸酯都有较好的灵敏度和线性范围。

2.4 线性范围、定量限、精密度和准确度

配制 5种氨基甲酸酯类化合物不同浓度的标准溶液，绘制标准曲线，以各目标组分定量离子色谱峰面积纵坐标，以各目标组分的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，5种目标组分在 10μg/L~500μg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数 r均大于0.999，回归方程见表6。

分别添加低水平的农药标准品到空白样品中，按照已建立的方法进行测定和分析，分别以信噪比（S/N）为3和10色谱响应值对应的浓度水平为检测限和定量限见表6。

以空白生菜样品试验，分别加入5种氨基甲酸酯类化合物，使得目标化合物在样品中的曲线浓度分别为 10、100、300 μg/L，按上述方法对样品进行处理和测定，平行重复6份，结果表明所有目标物的平均回收率在 75.3 %~109.8 %之间，相对标准偏差RSD<5 %，能够满足国内外对蔬菜中氨基甲酸酯类残留量检测方法的要求。

表6 氨基甲酸酯类农药回归方程、相关系数、检出限和定量限

序号	组分	回归方程	相关系数r	检出限（mg/kg）	定量限（mg/kg）
1	涕灭威亚砜	Y=4.379X-3.642	0.9996	0.003	0.01
2	涕灭威砜	Y=1024.69X+91.23	0.9952	0.003	0.01
3	3-羟基克百威	Y=10865.2X+4663.1	0.9974	0.003	0.01
4	涕灭威	Y=5319.04X+329.81	0.9967	0.003	0.01
5	克百威	Y=123549X+14819.5	0.9997	0.003	0.01

3 结论

本文根据氨基甲酸酯类化合物的结构特性和基质特点优化了提取条件和净化方法，建立了用乙腈涡旋振荡提取、改进的QuEChERS 法进行净化的前处理方法，避免了超声提取温度升高造成氨基甲酸酯农药分解的弊端，改进的 QuEChERS 方法极大节省了实验时间提高了工作效率，应用高效液相-质谱仪联用技术，建立并验证了快速而可靠地测定5种常见氨基甲酸酯农药残留的方法，在12min内完成 5种农药筛查，TQS质谱的高分辨率和高准确度确保了所有化合物的鉴定。方法较文献其他方法有较高的灵敏度，其定量限低于欧洲和日本法律所规定的限值，应用此方法很好的完成了食品污染物检测任务，能满足蔬菜样品中农药残留限量检测的要求。

4 参考文献

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