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新手上路-DAD功能帮助异常调查

viki

2022/09/01
研发分析之路

液相色谱（LC）

背景

用Agilent1260II仪器检测某项目中控时发现原料裂峰，降低进样量后仍然裂峰，排除溶剂效应。后怀疑是色谱柱柱效不好，通过更换色谱柱后，裂峰情况依然存在。

问题排查与解决

更换Agilent1260仪器后发现不裂峰,怀疑可能是一代和二代仪器型号差别引起的分离度差异问题。

深入调查

针对此情况，怀疑是仪器问题，调查Agilent1260II裂峰的原因。其他项目在Agilent1260II上并未出现此类情况。故重新将裂峰的样品进样，发现仍旧裂峰。

查看裂峰的紫外吸收波长，发现有两个吸收波长，一个是原料的吸收波长，另一个可能是杂质的吸收波长。两者的紫外吸收图不一致，最大吸收波长有区别的。所以这两个可能是不同的物质。

后重新查看Agilent1260II上正常峰的吸收波长，发现该峰的紫外吸收波长和Agilent1260上原料的吸收波长并不重叠，再次说明该峰里面包含杂质，未分开。

结论与总结

最后说明是有杂质未分开，与色谱柱和仪器无关。和技术员沟通了解到是合成人员在更改工艺，最终并不会采用这种工艺，所以并未优化该分析方法。

这个杂质异常分析过程提示我们要学会合理利用紫外吸收原理：对于同一物质，不论浓度大小如何，最大吸收峰所对应的波长（最大吸收波长 λmax）相同，并且曲线的形状也完全相同。这样可以帮助我们快速的判断异常峰的情况。

功能拓展-利用DAD峰纯度功能也可以确认是某峰是否包杂质

在DAD检测器上，检查某一色谱峰(A)的峰纯度，首先要对A进行恰当的积分，然后选择合适的参比(分自动和手动，一般选自动，特殊情况下选手动)，再选择波长范围(210nm-400nm较合适吧，再低会有基质的末端吸收干扰，会影响峰纯度检查的可信度，当然这要看具体的流动相及等梯度情况啦)，之后选择固定阈值(国家局要求在990及以上)，最后点一下要测的主峰就可以了。我简单的说一下峰纯度检查的原理吧，是这样的，当要检查某一色谱峰的峰纯度(A)时，软件会在A的起始点、前半中点、顶点、后半中点和结束点(共5点)分别取紫外全扫描图来进行拟合度检查，当拟合度大于阈值(即上述的990)时，软件默认为A的五个点都是一种物质，即A是一种物质的紫外吸收峰，纯的，相反，当拟合度低于阈值时，软件默认A的五个点不是一种物质，即A是两种或两种以上的物质的紫外吸收峰，不纯，就要再进行条件的优化分开它们了。所以峰纯度检查是选择有关物质检查色谱条件的重要环节之一，也就是方法的专属性啦。安捷伦一般是选择光谱归一化法计算峰纯度，简单的说就是从色谱峰上选择5个点(峰起始点、峰上升一半处的点，峰顶点、峰下降一半处的点及峰的结束点，

当然作为DAD也可以选择更多，提取这5个点的光谱图进行叠放，看其重合程度来判断色谱峰纯度。取这5个点的纯度因子平均值和阈值比较(一般采用固定阈值990即可)，大于990即为纯峰，反之则为不纯。

更多精彩内容请关注“研发分析之路”

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还是肉好吃

第1楼2022/09/02

没看懂，既然是有杂质未分开，和仪器与色谱柱无关，为什么1260II有裂峰，1260就没有了

0

0123gmail

第2楼2022/09/04

之前论坛有过一贴解释过这种现象。好像说是仪器固件的问题影响了比例阀的运作
还是肉好吃(v2738570) 发表:没看懂，既然是有杂质未分开，和仪器与色谱柱无关，为什么1260II有裂峰，1260就没有了

0

zyl3367898

第3楼2022/11/11

应助达人

加些小标题会更清晰。

0

myoldid

第4楼2022/11/28

应助达人

DAD检测器好处就是可以初步判定某个峰的纯度和辅助定性。安捷伦有个手册叫“了解您的化学工作站3D光谱”里面详细介绍了光谱功能的原理，我是没看懂，目前只能看看几个光谱图重合的好不好来判断峰纯不纯以及两个峰是不是一个东西

0

valorb

第5楼2022/11/28

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