菠菜中阿维菌素液相色谱法探讨
【摘要】本文讨论了用液相色谱法检测菠菜中阿维菌素时的一些问题,这些问题对试验结果的回收率、稳定性、检出限、精密度会产生影响。针对优化过程,对上述问题展开方法与结果研讨,方法改进后,提高了检测方法的准确性和精密度。关键词:菠菜 阿维菌素 液相色谱法
GB23200.19—2016《食品安全国家标准 水果和蔬菜中阿维菌素残留量的测定 液相色谱法》,前处理复杂,分析时间长,且该方法在实际检测过程中出现一些问题,如回收率低、检出限低、精密度差等问题,本文分析了造成这些问题的原因,并提出了有效解决办法。
一、材料与方法(一)前处理条件优化
称取试样20g丙酮提取,浓缩后残渣太多;布氏漏斗抽滤,每个样品需要清洗布氏漏斗,增加清洗工作量且易样品交叉污染;蔬菜、水果含水量比较高,40 ℃水浴旋转蒸发至约2 mL,浓缩到后面基本都是水。
1.样品称样量及提取溶剂、提取方法的选择
采取了称取试样20.0 g和10.0g,分别选择了乙腈、乙酸乙酯和丙酮三种提取溶剂。回收率与称样量没有直接关系,三种提取溶剂回收率分别为 56.9%、89.2%、93.8%,因此可选择称取试样10.0g,丙酮作为提取剂。
参考有关阿维菌素的提取方法相关文献报道,分别采用了离心、高速匀浆、超声三种提取方式。根据实验结果最后选择选择了超声提取 30 min后,于 4500r/min 条件下离心 5 min,待净化。
浓缩方法参考相关资料,分别比较了旋转蒸发和氮吹。根据实验结果,两种浓缩方法回收率分别为79.4%、95.7%,氮吹回收率相对较高。
2.净化过程中没有具体说明如何完全将浓缩提取液转入SPE C18柱。如果不润洗,回收率很低。本方法采取了用6mL丙酮/乙腈分3次润洗转入SPE C18柱,再用5ml的水淋洗,去掉淋洗液。最后用5 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,用氮气吹至近干。
(二)样品制备和标样的添加
图:阿维菌素标准曲线
检出限指用某一方法可定性检测到样品中残留物的最小浓度,该水平信噪比一般为3 ,阿维菌素检出限为 0.002 ng/μL ,灵敏度高。
定量限指可以对基质中目标残留物进行准确定量测定的最低水平,在该水平下得到的回收率和精密度应满足分析的要求,添加标准溶液质量浓度得到的信噪比一般为10,本试验添加回收率条件下,显示阿维菌素峰形及重现性较好且无杂质干扰,阿维菌素在菠菜中的定量限为 0.005 mg/kg,低于阿维菌素在菠菜中的最大残留限量。
阿维菌素在菠菜中的平均回收率为 93.8%~97.2%,相对标准偏差为 5.5%~8.0%,添加浓度包含定量限,最大残留限量值,添加浓度能覆盖本残留试验中所有样品最高残留量,且不同添加浓度均符合回收率要求,用回收率试验的相对标准偏差衡量检测方法的精密度,不同添加浓度对相对标准偏差均符合要求。
上述试验结果见表。
方法 | 样品量(g) | 提取方法及时间 | 浓缩方法 | 浓缩方法 | 测定值w/(mg?kg-1) | 回收率/% |
GB 23200.19-2016 | 20 | 丙酮,振荡 0.5 h 提取 | 40 ℃水浴旋转蒸发 | 不润洗旋蒸瓶 | 0.00473 | 47.3% |
方法1 | 10 | 丙酮,匀浆2min提取 | 40 ℃水浴旋转蒸发 | 润洗旋蒸瓶 | 0.00642 | 64.2% |
不润洗旋蒸瓶 | 0.00554 | 55.4% | ||||
45℃氮吹 | 润洗旋蒸瓶 | 0.00742 | 74.2% | |||
不润洗旋蒸瓶 | 0.00621 | 62.1% | ||||
方法2 | 10 | 丙酮,超声30 min,离心 5 min提取 | 40 ℃水浴旋转蒸发 | 润洗旋蒸瓶 | 0.00794 | 79.4% |
不润洗旋蒸瓶 | 0.00715 | 71.5% | ||||
45℃氮吹 | 润洗旋蒸瓶 | 0.00957 | 95.7% | |||
不润洗旋蒸瓶 | 0.00884 | 88.4% |
(一)色谱柱。当色谱柱污染后,峰面积会随着测定次数的增加而增加,影响测定结果的RSD值。实验过程中要确保色谱柱的干净程度,特别在进行比对时,要用干净的色谱柱。
(二)基质效应。同一种农药在不同蔬菜中有不同程度的基质效应,为了准确定量,理论上每种基质都需要制作对应的基质匹配标准曲线。为减少工作方法的工作量,在不影响结果准确性的前提下,选择一种有代表性的基质作为通用基质。
(三)为保证数据准确,在操作过程中还要注意以下几方面:
1.准确移取4mL上清液前,用该液润洗三次移液管,保证吸取刻度准确。
2.氮吹时气流大了容易把液体吹出造成损失,气流太小氮吹时间延长,都会影响回收率。氮吹近干要求小烧杯内壁有潮潮的一层,吹干后回收率小。氮吹过程中要用干净滤纸擦去针头上的水珠,防止水珠落入瓶中氮吹不准确,影响结果。
3.SPE C18柱使用前用 5 mL 甲醇和 5 mL 水活化,净化时小柱不能干,当溶剂液面到达柱吸附层表面时,立即倒入净化溶液。小柱干了不容易洗脱,影响回收率。
四、结论
本方法称取试样10 g,采用超声提取,净化浓缩处理后,采用高效液相色谱法测定阿维菌素的检出限为 0.002 ng/μL,定量限为 0.005mg/kg。样品添加质量浓度0.005、0.01、0.1 mg/kg,每个浓度重复 6 次,添加回收率为 92.5%~96.7%,相对标准偏差小于7.2%。此方法实验步骤操作简单,灵敏度高,经添加回收率实验表明得出的回收率、重复性均满足农药残留分析的要求,适用于水果、蔬菜中阿维菌素的批量检测。
参考文献: