仪器信息网APP

选仪器、听讲座、看资讯

立即体验

当前位置：仪器社区 >药物检测 > 生物制药 > 帖子详情

MSI1对小细胞肺癌细胞生长增殖的影响及相关机制研究

小小矮马

2022/10/10
小矮马

MSI1对小细胞肺癌细胞生长增殖的影响及相关机制研究

实验方法

检测MSI1对人小细胞肺癌细胞的生长增殖的影响

CCK-8实验检测小细胞肺癌细胞系生长增殖情况

分别将对数生长期的H69-NC、H69-shMSI1细胞离心，并用完全培养基调整细胞浓度，以每孔1.5×10⁴个细胞平铺于96孔板中，37℃恒温培养箱中培养。铺板后，分别于24 h、48 h、72 h、96 h在每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃、5%CO₂培养箱中孵育4h。并用酶标仪测定波长450 nm处OD值，结果应用t检验，利用Graphpad prism5计算增殖情况。

软琼脂克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力

用琼脂糖及ddH₂O分别配置0.3%与0.7%的软琼脂凝胶，高压灭菌后维持40℃不会凝固，按1:1比例将0.7%的软琼脂与2×1640培养基混合，将混合液置入6孔板中冷却凝固半小时，作为底层琼脂置于培养箱中备用。分别将对数生长期的H69-NC、H69-shMSI1细胞计数，按1:1比例将0.3%软琼脂凝胶与细胞悬液混合铺入上层，每孔细胞数为1000个，注意不要产生气泡。每2-3天滴加少量培养基，防止干燥。待上层凝固后放入恒温培养箱中培养2-3周后拍照计数克隆形成数及单个细胞团细胞数目，比较两种细胞克隆形成能力的差异，结果应用t检验，利用Graphpad prism5作图计算两种细胞克隆形成能力的差异。

MSI1影响小细胞肺癌细胞的相关机制研究

Western blot检测相关蛋白的表达

提取适量H69-NC、H69-shMSI1细胞总蛋白，20：1稀释后，与200 μL BCA工作液混合均匀。37℃孵育30 min，用酶标仪测定波长562 nm处OD值，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。在蛋白原液中加入相应体积4×SDS Loading Buffer，沸水浴煮5 min，分别取20 μg细胞总蛋白，在10% SDS-PAGE分离胶电泳。电泳结束后，将蛋白转至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的封闭液37℃封闭1.5 h。弃去封闭液，用TBST洗3次，加入相应抗体，4℃孵育过夜，TBST 洗膜3次，每次10 min。加入相应二抗（1:5000），37℃敷育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。用增敏化学发光底物试剂检测，暗室曝光显影。重复多次实验，应用ImageJ计算出各个蛋白条带的灰度对比，并应用Graphpad prism5作出柱状图。

MSI1对人小细胞肺癌细胞生长增殖能力的影响

实验检测MSI1对人小细胞肺癌细胞增殖能力的影响

CCK-8试剂可用于检测细胞生长增殖能力，过程简便精确。其基本原理为：试剂中含有的WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐），在电子载体的作用下被细胞中的脱氢酶还原为黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪测定450 nm处OD值，可间接反映活细胞数量。利用CCK-8实验检测H69-NC、H69-shMSI1细胞增殖能力，结果如图3-1显示，H69-shMSI1组OD值明显低于对照组，并且增长变化不明显。表明，MSI1低表达抑制小细胞肺癌细胞的生长增殖。

H69-NC、H69-MSI1细胞生长曲线。应用Graphpad prism5作图所示（*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001,表示与对照组相比，H69-shMSI1组OD值减小具有统计学意义）。

软琼脂克隆形成实验检测MSI1对人小细胞肺癌细胞单细胞克隆能力的影响

软琼脂克隆形成实验能够检测悬浮细胞单个细胞克隆形成的能力，培养2周后肉眼可见克隆形成，拍照并分别计数两种细胞克隆形成数量及单个克隆细胞团的细胞数目。结果如图3-2所示，与对照组相比，H69-shMSI1组形成的克隆数目明显减少（P＜0.01），克隆细胞团体积明显较小，并且通过计数单个克隆的细胞数发现，H69-shMSI1组单个克隆的细胞数明显低于对照组（P＜0.01）。该实验同样表明MSI1低表达对小细胞肺癌细胞的增殖具有抑制作用。

琼脂克隆形成实验。（a）软琼脂克隆形成实验镜下观察；（b）克隆形成率；（c）单个克隆形成的细胞数（***表示与对照组相比，H69-shMSI1组克隆形成率及单个克隆的细胞数减小具有统计学意义，P<0.001）。

MSI1影响人小细胞肺癌细胞的相关机制研究

MSI1低表达后肿瘤干细胞标志物CD133、CD44表达量下降

CD133、CD44为目前已知研究较为广泛的的肿瘤干细胞标志物，为了研究MSI1在人小细胞肺癌细胞系中与CD133、CD44的相关性，分别提取对数生长期H69-NC、H69-shMSI1细胞总蛋白，应用Western blot验证CD133、CD44在蛋白质水平的表达量。结果如图3-3所示，与对照组相比，H69-shMSI1组CD133、CD44的表达量明显降低。表明MSI1的敲低降低了小细胞肺癌细胞的干性，并且CD133、CD44的表达与MSI1具有相关性。

CD133、CD44蛋白的表达:（a）CD133、CD44蛋白条带；（b）CD133、CD44蛋白相对表达量（*代表与对照组相比，H69-shMSI1组CD133、CD44蛋白表达下降具有统计学意义，P<0.05）。

MSI1对人小细胞肺癌细胞EMT过程的影响

为了研究MSI1是否对小细胞肺癌EMT过程产生影响，分别提取对数生长期的H69-NC、H69-shMSI1细胞总蛋白，利用Western blot验证E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达量，结果如图3-4显示，与对照组相比，H69-shMSI1组N-cadherin、Vimentin表达量明显下降，而E-cadherin表达量增加，表明MSI1低表达后，小细胞肺癌细胞的EMT过程受到明显抑制。

EMT相关蛋白表达：（a）EMT相关蛋白表达条带；（b）EMT相关蛋白相对表达量（*代表与对照组相比，H69-shMSI1组EMT相关蛋白表达下降具有统计学意义，P<0.05）。

MSI1对人小细胞肺癌细胞凋亡过程的影响

细胞凋亡是多基因调控的细胞程序性的死亡，为了研究MSI1在人小细胞肺癌细胞中对细胞凋亡的影响，提取对数生长期的H69-NC、H69-shMSI1细胞总蛋白后，通过Western blot验证细胞凋亡相关蛋白的表达，结果如图3-5显示，与对照组相比，H69-shMSI1组凋亡相关蛋白cleaved caspase9、cleaved caspase3、cleaved PARP表达量明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量下调，PARP表达下降，表明MSI1低表达促进了小细胞肺癌细胞系凋亡过程。

图3-5 凋亡相关蛋白表达：（a）凋亡相关蛋白表达条带；（b）凋亡相关蛋白相对表达量（*代表P<0.05,**代表P<0.01,表示与对照组相比，H69-shMSI1组凋亡相关蛋白表达下降具有统计学意义）。

主要研究MSI1对小细胞肺癌细胞生长增殖的影响及相关机制，首先利用CCK-8实验及软琼脂克隆形成实验验证MSI1低表达后小细胞肺癌细胞的生长增殖能力。结果显示，H69-shMSI1组细胞生长速度明显减慢，单个细胞克隆能力明显降低，表明MSI1低表达后抑制了小细胞肺癌细胞系的生长增殖。通过western blot实验检测肿瘤干细胞标志物CD133、CD44的表达。结果显示，MSI1低表达后肿瘤干细胞标志物CD133、CD44表达量下降，表明MSI1的敲低降低了小细胞肺癌细胞的干性，CD133、CD44的表达量可能与MSI1具有相关性，但具体机制尚不清楚，需进一步研究。EMT过程是肿瘤转移过程的关键步骤，MSI1敲低后间充质标志物N-cadherin、Vimentin表达量下降，而上皮标志物E-cadherin表达量增加，表明MSI1敲低抑制了EMT过程。通过验证凋亡相关蛋白发现，凋亡相关蛋白cleaved caspase9、cleaved caspase3、cleaved PARP表达量明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量下调，PARP表达下降，表明敲低MSI1后促进了凋亡的产生。Wnt/β-Catenin通路在细胞生长发育过程中具有重要作用，在多种肿瘤中表达失调，β-Catenin是Wnt信号通路关键下游靶点，MSI1低表达使β-Catenin表达量下降，表明MSI1在人小细胞肺癌细胞中也通过激活Wnt通路发挥作用。

附件：

Y10MSI1对小细胞肺癌细胞生长增殖的影响及相关机制研究.docx

相关话题

小兰兰小叮当

第1楼2022/11/16

点赞好文章

0

小兰兰小叮当

第2楼2022/11/17

推荐好文章

0

近期热榜

热门活动

猜你喜欢最新推荐热门推荐更多推荐

品牌合作伙伴

日立科学仪器

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

日本电子株式会社

赛默飞世尔科技

马尔文帕纳科

上海仪电科仪

梅特勒托利多

布鲁克核磁

举报帖子

点赞用户

好友列表

加载中...

正在为您切换请稍后...