蛋白提取、浓度测定及WB操作方法

蛋白提取、浓度测定及WB操作方法

将对数生长期的 H69-NC、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2 、 H526-NC 、 H526-shMSI1-1 、 H526-shMSI1-2 、 SW1271-NC 、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞移入 15 mL 离心管中，900 rpm/min 离心 8min，并用 PBS 溶液洗涤 2 次，以去除培养基中血清影响。分别加入蛋白裂解液 100μL，与细胞充分混匀。4℃ 裂解 1 小时后，4℃，12000 rpm/min 离心 15 min，将上清移至新的离心管中，得到细胞总蛋白。

1.%2.%3.%4 BCA 法测定蛋白浓度

将 Solution A 和 Solution B 以 50:1 的体积比配置 BCA 工作液，充分混匀。将 2mg/mL 蛋白标准品等比稀释，最小浓度为 125 μg/mL，并分别与配置好的 200 μL BCA 工作液混匀，铺入 96 孔板中。37℃ 孵育 30 min，测定波长 562 nm 处 OD（光密度值） 值，并绘制蛋白标准曲线。取 4 μL 的 H69-NC、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2、SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞总蛋白，1：20 稀释后，与 200 μL BCA 工作液混合均匀。37℃ 孵育 30 min，用酶标仪测定波长 562 nm 处 OD 值，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

Western blot 检测 MSI1 在蛋白水平的表达

Western blot 检测 MSI1 蛋白的表达

分别收集对数生长期的 H69-NC 、H69-shMSI1-1 、H69-shMSI1-2 、H82-NC 、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2、SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞总蛋白，加入相应体积 4×SDS LoadingBuffer，沸水浴煮 5 min，分别取 40 μg 细胞总蛋白，在提前配制的 10% SDS-PAGE 分离胶电泳。电泳结束后，将蛋白转至 PVDF 膜上。用含 5% 脱脂牛奶的封闭液 37℃ 封闭 1.5 h。弃去封闭液，用 TBST 缓冲液洗 3 次，每次 10 min，加入 MSI1 兔单克隆抗体（1:1000），并以 GAPDH 为内参，加入 GAPDH 鼠单克隆抗体（1:5000）；4℃ 孵育过夜，次日用 TBST 缓冲液洗膜 3 次，每次 10 min。在敷有 MSI1 抗体的膜上加入辣根酶标记山羊抗兔 IgG（1:5000），在敷有 GAPDH 抗体的膜上加入辣根酶标记山羊抗鼠 IgG（1:5000），37℃ 敷育 1 h，TBST 缓冲液洗膜 3 次，每次 10 min。用增敏化学发光底物试剂检测，暗室曝光显影。在 GAPDH 表达量相同的情况下比较MSI1 的表达情况。多次重复。