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蛋白提取、浓度测定及WB操作方法

  • 小小矮马
    2022/11/23
    小矮马
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分离/萃取

  • 蛋白提取、浓度测定及WB操作方法

    将对数生长期的 H69-NCH69-shMSI1-1H69-shMSI1-2H82-NCH82-shMSI1-1H82-shMSI1-2 H526-NC H526-shMSI1-1 H526-shMSI1-2 SW1271-NC SW1271-shMSI1-1SW1271-shMSI1-2 细胞移入 15 mL 离心管中,900 rpm/min 离心 8min,并用 PBS 溶液洗涤 2 次,以去除培养基中血清影响。分别加入蛋白裂解液 100μL,与细胞充分混匀。4 裂解 1 小时后,4℃,12000 rpm/min 离心 15 min,将上清移至新的离心管中,得到细胞总蛋白。

    1.%2.%3.%4 BCA 法测定蛋白浓度

    Solution A Solution B 50:1 的体积比配置 BCA 工作液,充分混匀。将 2mg/mL 蛋白标准品等比稀释,最小浓度为 125 μg/mL,并分别与配置好的 200 μL BCA 工作液混匀,铺入 96 孔板中。37 孵育 30 min,测定波长 562 nm OD光密度值) 值,并绘制蛋白标准曲线。取 4 μL H69-NCH69-shMSI1-1H69-shMSI1-2H82-NCH82-shMSI1-1H82-shMSI1-2H526-NCH526-shMSI1-1H526-shMSI1-2SW1271-NCSW1271-shMSI1-1SW1271-shMSI1-2 细胞总蛋白,120 稀释后,与 200 μL BCA 作液混合均匀。37 孵育 30 min,用酶标仪测定波长 562 nm OD 值,根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

    Western blot 检测 MSI1 在蛋白水平的表达

    Western blot 检测 MSI1 蛋白的表达

    分别收集对数生长期的 H69-NC H69-shMSI1-1 H69-shMSI1-2 H82-NC H82-shMSI1-1H82-shMSI1-2H526-NCH526-shMSI1-1H526-shMSI1-2SW1271-NCSW1271-shMSI1-1SW1271-shMSI1-2 细胞总蛋白,加入相应体积 4×SDS LoadingBuffer,沸水浴煮 5 min,分别取 40 μg 细胞总蛋白,在提前配制的 10% SDS-PAGE 分离胶电泳。电泳结束后,将蛋白转至 PVDF 膜上。用含 5% 脱脂牛奶的封闭液 37 封闭 1.5 h。弃去封闭液,用 TBST 缓冲液洗 3 次,每次 10 min,加入 MSI1 兔单克隆抗体1:1000),并以 GAPDH 为内参,加入 GAPDH 鼠单克隆抗体1:5000);4 孵育过夜,次日用 TBST 缓冲液洗膜 3 次,每次 10 min。在敷有 MSI1 抗体的膜上加入辣根酶标记山羊抗兔 IgG1:5000,在敷有 GAPDH 抗体的膜上加入辣根酶标记山羊抗鼠 IgG1:5000),37 敷育 1 hTBST 缓冲液洗膜 3 次,每次 10 min。用增敏化学发光底物试剂检测,暗室曝光显影。在 GAPDH 表达量相同的情况下比较MSI1 的表达情况。多次重复。

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