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实时荧光定量PCR(RT-PCR)及细胞增殖实验操作

  • Ins_7c331746
    2022/11/30
    小矮马
  • 私聊

生物制药

  • 实时荧光定量PCRRT-PCR及细胞增殖实验操作

    选择管家基因GAPDH作为内参基因,以H69作为对照组,检测四种亚型标志物ASCL1NEUROD1YAP1POU2F3H69H446H526DMS114细胞系中的相对表达量。并根据实验得到的CT值,采用2-△△CT法计算相对表达量。

    本实验所用引物如下:

    表1 引物序列

    本研究应用10 μLPCR反应体系。

    1)将试剂解冻,上下颠倒混匀(勿剧烈摇动)后置于冰上。

    2)将引物工作液解冻,混合均匀后置于冰上,DEPC水也置于冰上。

    3)冰上配制PCR反应混合液。

    RT-qPCR反应试剂



    4)将PCR混合液混匀,不要涡旋,吸取9 L至反应管内,随后加入1 μL cDNA模板,阴性对照不加cDNA模板,移液枪小心混匀。

    5)加样结束后,八连管封盖,并将反应管内的气泡甩掉,收集反应液于管底。

    6)设置PCR反应程序。

    定量PCR反应程序

    7)将8连管或PCR 96孔板放入仪器开始反应。

    CCK-8法检测细胞增殖

    取对数生长期的H69H446H526DMS114细胞,其中H446H69H5261×104个细胞/孔的细胞密度接种于 96 孔板中,DMS1144×103个细胞/孔的细胞密度接种于 96 孔板中细胞融合率约80%加入不同浓度西达本胺。每组均设置DMSO对照组及空白组(仅有同体积培养基)。H446加药浓度梯度为 00.512481632 μmol/LH69加药浓度梯度为02.55102040 μmol/LH526加药浓度梯度为01.252.55102040 μmol/LDMS114加药浓度梯度为01248163264 μmol/L(加药浓度梯度根据细胞类型、前期预实验结果及细胞对药物的敏感程度而定)。浓度设6个复孔,每孔总体积为100 μL,培养24487296120 h检测细胞活力。每孔加入10 μLCCK-8(避光),培养箱中孵育2-4 h后取出,使用酶标仪测定波长为450 nm的吸光度OD利用公式:抑制率=(加药组空白组)/(对照组空白组)计算增殖抑制率。实验重复3次,取平均值。以药物浓度为横坐标,细胞增殖抑制率为纵坐标绘图使用SPSS23.0计算IC10IC20IC50,取平均值作为后续实验药物浓度。

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