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【转帖】高效液相色谱柱的正确使用及维护

quguohua

2007/04/27

液相色谱（LC）

2　影响色谱柱使用寿命的主要因素
2. 1　流动相因素
2. 1. 1　流动相pH　不同基质的填料具有不同的pH适用范
围。常温下无定形硅胶在纯水中的溶解度约为100 mg·
L - 1 ,且在pH 1～9的范围内溶解的硅胶量几乎是常量,考虑
到溶解速度的影响,对于硅胶基质的填料,其所能承受的流动
相pH范围约为1～8[ 2 ]。键合相硅胶填料则由于键合层的屏
蔽作用,使填料对流动相的适应范围大大增加,如现在广泛使
用的反相色谱填料C1 8 (十八烷基硅烷键合硅胶) ,其pH适用
范围可达2～10。当流动相pH值超出酸性范围时,键合相易
发生水解而流失;当流动相pH超出碱性范围时,会加速硅胶
的溶解而释放出絮状物堵塞柱子,这两种反应均是不可逆反
应,特别是在温度较高( > 40℃)的环境下,会使柱效迅速降
低而报废。
2. 1. 2　流动相变质　当前使用最为广泛的是硅基键合相填
料,当以水溶液作为流动相或流动相中含有一定浓度的磷酸
盐缓冲液时,水溶液中或缓冲盐溶液中会滋生出一些细菌或
霉菌,从而堵塞固定相颗粒间的空隙。特别是对于多元自动
比例混合的高效液相色谱仪来说,水相或缓冲盐相独立存贮,因存放时间较长而容易发生此类问题。
2. 1. 3　流动相纯度　目前广泛使用的填料颗粒粒径范围在
3～10μm,孔径在6～10 nm,色谱柱在使用中会有大量的流
动相通过,如流动相含有微量不溶性杂质颗粒,则很容易在柱
头部位被截留,久而久之,造成色谱柱机械性堵塞,引起柱压
升高而无法正常使用。
2. 1. 4　其它因素　如流动相的极性对柱子也有一定影响,甲
醇、水、冰醋酸等极性较大的物质会破坏硅胶填料柱,正丁醇、
二氯甲烷等极性小的物质会破坏化学键合硅胶柱,碱性溶液
会破坏阳离子交换树脂色谱柱,酸性溶液容易损坏阴离子交
换树脂柱[ 3 ]。
2. 2　样品因素
2. 2. 1　样品的溶解性　样品试样在配制中,如有少量微粒未
能完全溶解,则会随试样一起进入色谱柱,同样会沉积在柱头
处,造成色谱柱的堵塞。
2. 2. 2　样品的纯度　样品中可能含有待分析组分以外的各
种组分或杂质,这些组分或杂质可能会在柱内产生不可逆吸
附,从而使固定相的活性点被覆盖,保留特性发生变化。
2. 2. 3　样品的化学性质　待测试样中的各种组分与填料之
间应具有化学稳定性,比较典型的是在使用氨基键合柱时,应
避免使用含羰基的化合物和流动相,如丙酮、乙酸乙酯等,以
免固定相中的NH2 和酐、酮发发希夫( Schiff)缩合而使固定
相破坏[ 3 ]。
2. 3　其它因素　影响色谱柱寿命的因素很多,除流动相和样
品因素外,还有其它一些外在因素,如柱压的影响,温度的影
响,色谱柱的正确冲洗,色谱柱的正确安装等。
3　高效液相色谱柱的正确使用
3. 1　加装保护柱　保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样
品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不
溶物。尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、进样阀后部以及
在色谱柱的两端都装有1、2μm等不同孔径的滤器,但滤器
只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污然,因此,加装保护柱
是必要的,特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样
品时更是保护分析柱必不可少的措施。保护柱填料应与分析
柱一致,粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品,经过一定次数
的样品分析(50～100次)后,出现柱压显著升高或峰形变坏
或基线漂移时,应考虑更换保护柱。
3. 2　过滤流动相和样品　流动相通常由水或缓冲溶液与有
机溶剂混合而成,原则上,所有经过色谱柱的流动相均应过
滤,但在实际操作上应视具体情况而有所区别:当有机溶剂用
色谱纯级,水用石英亚沸水或其它超纯水时,在能确保水和有
机溶剂的质量且没有受到污染时,过滤并无更多实际意义。
当流动相中含有缓冲盐时,则过滤是必要的,如前所述,当缓
冲溶液放置一段时间(视环境温度不同而异,夏季一般不超
过48 h,冬季一般不超过一周)后,在使用前还应重新过滤。
所配制的样品试液在注入流路系统前均要经0. 45μm ( 0. 22μm则更好)孔径滤膜过滤。要注意区分水系和油系,二者不
可混用,以防止滤膜溶解而造成污染。装流动相的容器和色
谱系统中的在线滤器要定期清洗和更换,以避免滤器因过载
而起不到过滤作用。
3. 3　净化样品　当样品中含有对色谱柱有损害的化学成分,
如产生永久性吸附的蛋白质、糖等有机分子和强吸附性物质,
以及可能对柱填料产生破坏作用的基团离子。在进样前应尽
可能对样品进行分离提纯以除去多余杂质组分。
3. 4　避免过高的柱压　虽然高效液相色谱柱能耐受的压力
可达6000 p si (磅/平方英寸) ,但过高及过大的压力变化均会
缩短色谱柱的寿命,避免的方法是(1)柱压过高时,尽可能采
用较小的流速,以不超过柱最大允许压力的一半为宜。( 2)
当流速较大时,应采取流速梯度的办法使流速分步到位。
(3)使用手动进样阀时,进样阀的切换要尽可能的快。否则
超过20%的压力冲击会很快使柱报废。当使用多柱联用时,
柱切换要避免在高压下进行。
3. 5　注意温度和酸碱度　一般以硅胶为基质的色谱柱最高
使用温度不超过60℃,以低于40℃为宜,特别是在流动相pH
接近使用限度时,更应降低使用温度。温度过高会加快键合
相的水解和硅胶的溶解,从而使填料性质改变,柱床塌陷,降
低柱效,改变峰形。目前的键合硅胶色谱柱标示的pH适用
范围可达2～10,但在实际使用时应避免极端的pH条件,特
别是在偏碱性的条件(pH≥8)下使用[ 4 ] ,如必须要在极端的
pH条件下使用时,可通过以下方法避免柱损害: ( 1)在泵和
进样阀之间加装预柱(饱和柱)来饱和流动相(2)降低使用温
度(3)检验完毕后立即用与所使用的流动相互相混溶的“温
和溶剂”彻底清洗。
3. 6　正确及时的冲洗　开始试验前,应了解柱中当前是何种
溶剂。对于新色谱柱,如无特殊说明均为评价报告中所用流
动相[ 4 ]。柱中当前溶剂一定要与分析样品所用流动相互溶,
如不能混溶,要用与二者均能相互混溶的第三种溶剂过渡。
异丙醇是唯一能与各种溶剂混溶的试剂,可作为中介流动相
使用。反相键合硅胶柱适宜的保存环境是纯甲醇,如分析用
流动相为缓冲液2有机溶剂,可先用较低甲醇含量( < 20% )的
甲醇2水置换掉原来的纯甲醇,再进分析用流动相,以防止在
柱内发生盐的沉淀;试验结束后,要及时用适当的溶剂冲洗系
统并最终过渡到纯甲醇冲洗,对于含有缓冲盐的流动相,最好
的办法是先用与分析用流动相组成完全相同但不含缓冲盐的
溶液进行冲洗,再逐步过渡到纯甲醇冲洗。多数报道冲洗液
体积大约为柱容积的15～20倍,但最终要以基线是否平直、
压力是否稳定决定。有些厂家的色谱柱标明了流动相中有机
相的最低使用浓度为≥5% ,使用时应给予注意。
4　高效液相色谱柱的维护

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剑神一笑

第1楼2007/04/29

大家赚取积分啊，也不要让别人受打击

0

zengxiaoliang

第2楼2007/04/30

哇。。终于让我明白了这么多的东西，谢谢啦。

0

sunhonny

第3楼2007/04/30

好帖子顶你～～～～～·

0

zhouk2006

第4楼2007/06/13

学习！！！！！

0

Angela

第5楼2007/06/13

谢谢，很实用--有指导性。

0

rushuang

第6楼2008/01/18

多谢共享，很好的东西

0

tian501

第7楼2008/01/18

好东西啊!
有意义.

0

tingting001

第8楼2008/05/05

很好的东西，让我受益匪浅，谢谢楼主。

0

ylyra1984

第9楼2008/05/13

论坛的好资料真多哦，要好一阵子学习了。。先收藏

0

风烟

第10楼2008/05/13

收藏先……谢谢楼主……

0

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