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乳制品微生物法检验泛酸过程及注意事项
Jun Nan Li
2023/08/01
私聊
乳制品检测
乳制品微生物法检验泛酸过程及注意事项
微生物法测定原理:
泛酸是植物乳杆菌生长所必需的营养素
,
在一定控制条件下
,
将植物乳杆菌液接种至含有试样液的培养液中
,
培养一定时间后测定透光率
(
或吸光度值
),
根据泛酸含量与透光率
(
或吸光度值
)
的标准曲线计算出试样中泛酸的含量。
1.
试管处理
所用试管使用前洗刷干净
,
用水煮沸
30min ,
沥干后放入盐酸浸泡液中浸泡
2h ,
经
170
℃ 烘
3h
后使用。
2.试
液配制
乙酸溶液
( 0. 2mol/ L ):
吸取
11.8mL
冰乙酸
,
用水稀释至
1000mL ,
混匀。
乙酸钠溶液
( 0. 2mol/ L ):
称取
27.2g
三水合乙酸钠
,
加水溶解并稀释至
1000mL
,混匀。
氢氧化钠溶液
( 1mol/ L ):
称取
40g
氢氧化钠
,
加水溶解并稀释至
1000mL ,
混匀
氢氧化钠溶液
( 0.1mol/ L ):
称取
4g
氢氧化钠
,
加水溶解并稀释至
1000mL ,
混匀。
生理盐水
:
称取
9g
氯化钠
,
加水溶解并稀释至
1000mL ,
混匀。临用前预先灭菌
,
于
121
℃ 高压灭菌
10min
后备用。
乙醇溶液
( 20% ):
量取
200mL
无水乙醇与
800mL
水混匀。
3.
标准溶液的配制
泛酸标准储备溶液
( 40. 0
μ
g / mL ):
精确称取
43. 5mg
预干燥至恒重的
D-
泛酸钙
,
加水溶解并转移至
1000mL
容量瓶中
,
加
10mL
乙酸溶液
, 100mL
乙酸钠溶液
,
用水定容至刻度。储存于棕色瓶中
,
加入
3
滴
~5
滴甲苯
,
于
2
℃
~4
℃ 冰箱中可保存
2
年。
泛酸标准中间液
( 1. 00
μ
g / mL ):
准确吸取
25. 0mL
泛酸标准储备溶液置于
1000mL
容量瓶中
,
加入
10mL
乙酸溶液
,100mL
乙酸钠溶液
,
用水定容至刻度。加入
3
滴
~5
滴甲苯于
2
℃
~4
℃ 冰箱中可保存
1
年。
泛酸标准工作溶液
( 20ng / mL ):
准确吸取
2. 00mL
泛酸标准中间溶液置于
100mL
容量瓶中
,
用水定容至刻度
,
混匀。临用前现配。
4.
储备菌种的制备
将菌种植物乳杆菌转接至琼脂培养基中
,
在
37
℃±
1
℃ 恒温箱中培养
20h~24h ,
连续传种
2
次
~3
次。取出后放入
2
℃
~4
℃ 冰箱作为储备菌株保存。每月至少传代一次
,
不宜超过
25
代。试验前将储备菌株接种至琼脂培养基中
,37
℃±
1
℃ 恒温培养箱中培养
20h~24h
以活化菌株
,
用于接种液的制备。
注
:
保存数周以上的储备菌株
,
不能立即用作接种液制备
,
试验前宜连续传种
2
代
~3
代以保证细菌活力。
5.
接种液的制备
试验前一天
,
取
2mL
泛酸标准工作溶液和
4mL
泛酸测定用培养液混匀
,
分装于
2
支
5mL
离心管中
,
塞好棉塞
,
于
121
℃ 高压灭菌
10min
后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至
2
支种子培养液中
,
于
37
℃±
1
℃ 恒温培养箱中培养
20h~24h
。
取出后
3000r / min
离心
10min ,
弃上清液
,
无菌操作下用已预先灭菌的生理盐水淋洗
2
次
, 3000r / min
离心
10min ,
弃上清液。再加入
3mL
灭菌生理盐水
,
振荡混匀
,
制成接种液
,
立即使
用。
8.
标准系列管:
泛酸标准工作溶液
/mL
0
0.5
1
1.5
2.0
2.5
3
3.5
4
4.5
5
加水量
/mL
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
泛酸测定用培养基
/mL
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
9.
灭菌:
将所有测定管塞好棉塞
,
于
121
℃ 高压灭菌
10min
。
接种和培养:待测定系列管冷却至室温后
,
在无菌操作条件下向每支测定管滴加接种液
50
μ
L
。塞好塞子
,
置于
37
℃±
1
℃ 恒温培养箱中培养
16h~20h ,
直至达到最大混浊度
,
即再培养
2h
后透光率
(
或吸光度值
)
无明显变化。另准备一支标准
0
管
(
含
0ng
泛酸
)
不接种作为
0
对照管。
测定:将培养好的标准系列管、试样管用漩涡混匀器混匀。用厚度为
1cm
比色杯
,
于
550nm
处
,
以未接种的
0
对照管调节吸光度值为
0,
依次测定标准系列管、试样管的吸光度值。
如果
0
对照管有明显的细菌增长
,
或者与
0
对照管相比
,
标准
0
管透光率在
90%
以下
(
或吸光度值在
0.2
以上
);
或标准系列管透光率最大变化量
<40% (
或吸光度值变化量
<0.4 ,
说明可能有杂菌或不明来源的泛酸混入
,
需重做试验。
10.
标准曲线
以标准系列管泛酸含量为横坐标
,
每个标准点透光率
(
或吸光度值
)
均值为纵坐标
,
绘制标准曲线。
11.
试样结果计算
从标准曲线查得试样管中泛酸的相应含量
(
ρ
x ),
如果每个试样的
4
支试样系列管中有
3
支以上泛酸含量
10ng~80ng
范围内
,
且计算每毫升试样稀释液中泛酸浓度
(
ρ
),
各管之间相对偏差小于
15% ,
则可继续进行结果计算
,
否则需重新取样测定。
最后一张附图是梯度生长的后的状态,供大家实验参考。
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0
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