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高效液相色谱串联质谱法测定动物源性食品中的喹诺酮类抗生素残留

wzq123

2023/08/01
安阳疾控理检队

私聊

气质联用（GCMS）

引言喹诺酮类药物（QNs）是吡啶酮酸类化合物，属于人工合成的广谱抗菌药，主要用于细菌性感染的预防与治疗，其杀菌力强，作用迅速，被广泛用于畜牧、水产养殖中^[1-3]。此类药物在动物体内代谢缓慢，部分经肝脏代谢，大部分以原形经肾脏排泄，对肝、肾有一定损害，并残留在动物源性食品中，由于非法使用、滥用、超标使用兽药，不遵守休药期的规定等现象普遍存在，因此喹诺酮类药物的残留安全问题已引起社会的广泛关注^[4-5]。长期食用含有残留抗生素的食品会有害健康，引起慢性中毒和耐药菌的产生^[^6-7^]，而且对生态环境带来不利影响。这类药物作为新型污染物(PPCPs)，我国以及世界卫生组织、欧盟、美国、日本等国家和组织都将 QNs 列入限制使用的兽药名单中，并制定出相关的最高残留量(MRL)^[8]。本文采用QuEchERs法前处理样品，UPLC-MS/MS测定动物源性食品中的喹诺酮残留，不仅可以提高样品中残留抗生素的提取效率，而且可以减少前处理的操作步骤，样品前处理更加简便、快速、灵敏、高效，经济、环保，检测结果准确可靠，对于保障食品安全和人体健康具有十分重要的意义。

1.材料与方法

1.1仪器与试剂

TQ-S Waters高效液相色谱串联质谱仪(Waters 公司，美国）、N-EVAP112氮吹仪（Organomation公司，美国）、C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司，美国）

甲酸（色谱纯）；乙腈（色谱纯，美国Fisher）；冰乙酸（优级纯）；Na₂EDTA（优级纯）；

喹诺酮类药物标准物质：氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、恩诺沙星、二氟沙星、奥索利酸、氟甲喹、单诺沙星、沙拉沙星（TanMo,中国）

1.2样品制备

1.2.1动物肌肉和动物内脏：取适量新鲜或冷冻解冻的动物组织样品去筋、捣碎均匀。

1.2.2 牛奶：取适量新鲜或冷冻解冻的样品混合均匀。

1.2.3 鸡蛋：取适量新鲜或冷冻解冻的样品，去壳后混合均匀。

1.3样品提取

称取均质试样2 g（精确到0.01 g），置于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL含冰乙酸-乙腈-水溶液（1+84+15）和0.1 g Na₂EDTA震荡1 min再超声15 min，9000 r/min离心5 min ，取上清液备用。

1.4样品净化

另取一个15 mL聚丙烯离心管，加入250 mg DSC-18吸附剂，再移入上述上清液6 mL，震荡1 min，9000 r/min离心5 min，取上清液1 mL，过膜后上机测定。

1.5测定条件

1.5.1 液相色谱条件

Waters C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），进样量 5.0 μL，流动相A为0.2%甲酸水溶液，B乙腈，流速为 0.3 mL/min，梯度洗脱。梯度洗脱程序见表1

表1 11种喹诺酮类抗生素的梯度洗脱条件

时间（min）	流动相A%	流动相B%
	10	90
4	50	50
5	100	0
6	100	0
7	10	90

1.5.2质谱条件

电喷雾电离正离子模式（ESI+），采用多反应离子监测方式（MRM）进行分析，离子源温度 150 ℃，碰撞气Ar，辅助气N₂。质谱参数见表2

表2 11种喹诺酮类抗生素的主要质谱条件

化合物	保留时间（min）	母离子	子离子	碰撞能量（V）	锥孔电压
恩诺沙星	2.30	360.2	316.1^*	25	32
			245	20
诺氟沙星	2.13	320	271.1^*	25	32
			233	20
培氟沙星	2.15	334.1	316.1^*	19	34
			270.1	19
环丙沙星	2.19	332.1	314.1^*	18	32
			288.1	22
氧氟沙星	2.12	362.1	318.1^*	25	32
			261.1	20
沙拉沙星	2.70	386.2	342.1^*	27	37
			299.1	18
洛美沙星	2.34	352.1	265.2^*	22	31
			308.1	16
奥索利酸	3.46	262	244^*	30	30
			216	19
氟甲喹	4.52	262	244^*	32	30
			202	21
单诺沙星	2.30	358.2	314.1^*	25	32
			96.0	20
二氟沙星	2.70	400.2	356.1^*	27	37
			299	21

*为定量离子

2.结果与讨论

2.1定性与定量测定

采用全扫描监测离子方式 ,提高了灵敏度 ,同时达到 11 种QNs药物完全检出, 每种化合物选择 2～3 个二级特征离子 ,根据这 2～ 3 个特征离子,结合保留时间,可对样品中存在的QNs药物进行定性,特别对于在复杂基质中与喹诺酮化合物保留时间一致而不是磺胺和喹诺酮的化合物的假阳性结果可进行排除^[9]。定量则选择一个干扰小、特征性高的二级离子,采用标准曲线外标法通过工作站进行定量。

2.2方法的线性与检出限

以空白基质提取液配制成混合标准系列，各组分浓度分别为：2.50、5.00、10.0、20.0、50.0、100 μg/L。在2.50 ～100 μg/L浓度范围内，目标化合物均具有良好的线性关系，相关系数均在0.99以上。按 3倍信噪比和 10 倍信噪比计算方法最低检出限和定量限，11种QNs 药物最低检出限和定量限分别为0.65～0.90 μg/kg和 2.20～2.98 μg/kg。见表3

表3 11 种 QNs的回归方程、相关系数、最低检出限和定量限

	回归方程	相关系数	最低检出限μg /kg	定量限μg/kg
恩诺沙星	Y=34845.7x－13905.3	0.9991	0.90	2.98
诺氟沙星	Y=11307.9x-16034	0.9987	0.65	2.20
培氟沙星	Y=31851.1x-23767.6	0.9995	0.65	2.20
环丙沙星	Y=11321.3x-9630.6	0.9990	0.90	2.98
氧氟沙星	Y=60256.4x-38277.7	0.9989	0.65	2.20
沙拉沙星	Y=11199.5x-13000.2	0.9982	0.65	2.20
洛美沙星	Y=36640.5x-37306.1	0.9994	0.65	2.20
奥索利酸	Y=16263.3x-19754.6	0.9962	0.65	2.20
氟甲喹	Y=34370.6x-713.092	0.9970	0.65	2.20
单诺沙星	Y=35234.6x-52073.3	0.9975	0.65	2.20
二氟沙星	Y=25130x-11516.2	0.9983	0.90	2.98

2.3方法的回收率和标准偏差

以未检出喹诺酮类抗生素的空白样品作为测试样品，加标量为5.0、10.0、50.0 μg/kg，每个加标浓度做6个平行样品，样品经QuEchERs法处理后11种喹诺酮类抗生素的加标回收率为73.8 %～96.9 % ，RSD为4.13 %～7.80 %。结果见表4

表4 11种喹诺酮类抗生素的加标回收率及RSD(n=6)

检测项目	加标量5.0 μg/kg		加标量10.0 μg/kg		加标量50.0 μg/kg
检测项目	回收率%	RSD%	回收率%	RSD%	回收率%	RSD%
恩诺沙星	75.8	6.44	84.0	7.21	85.2	6.23
诺氟沙星	88.0	5.96	87.3	6.53	89.0	5.25
培氟沙星	84.2	4.56	89.2	5.40	93.4	4.37
环丙沙星	86.4	6.01	91.5	4.62	87.9	5.49
氧氟沙星	92.8	5.16	96.9	5.04	91.4	4.76
沙拉沙星	76.5	6.74	85.4	5.13	90.8	5.60
洛美沙星	94.3	6.33	93.1	5.74	95.7	4.36
奥索利酸	76.2	7.27	86.2	6.01	81.6	5.78
氟甲喹	73.8	7.80	75.4	6.86	85.1	5.48
单诺沙星	84.2	7.24	89.3	6.73	88.6	6.04
二氟沙星	83.1	5.60	86.0	5.49	87.7	4.13

2.4提取与净化条件的选择

喹诺酮（QNs）为极性化合物，易溶于极性和水溶性有机溶剂、稀酸和碱溶液，不溶于非极性溶剂。动物源性食品中QNs的提取剂大致可分为4种:1)水不溶性有机溶剂:如二氯甲烷;2)强极性有机溶剂:如乙腈、甲醇和乙酸乙酯;3)水溶性有机溶剂和酸、碱的混合液，如盐酸/磷酸/乙酸- 乙腈等;4)缓冲溶液:如磷酸和柠檬酸缓冲溶液等。综合考虑本试验用EDTA 缓冲液作为提取剂，既可以提供相应的pH 值条件，又可以满足QNs 物质的提取要求，更避免使用大量有机溶剂引起的污染。

2.5基质效应的影响

质谱分析易受样品基质的影响，样品基质对离子化有非常强的抑制或促进作用，影响定量分析^[10]，为了得到可靠的定量结果，须采用基质匹配校正曲线进行定量分析，使标准溶液和样品溶液具有相同的离子化条件，从而消除样品中基质效应对喹诺酮类药物定量测定的影响。

2.6实际样品检测

检测了鸡肉类样品30 份，检出阳性样品1 份，含恩诺沙星16.2 μg/kg，其余均未检出。

3. 结论

QuEchERs是近年来应用日趋广泛的分散固相萃取样品前处理技术，样品经超声提取，经吸附剂净化后，直接取上清液上机测定，与固相萃取法相比，不需要HLB萃取柱，在保证检测精度的基础上，不仅节省了试剂耗材，且极大缩短了样品处理时间，使得样品前处理更加简便、快速、高效，更经济、环保，本研究利用QuEchERs法处理动物源性食品，高效液相色谱串联质谱法测定喹诺酮类抗生素残留，适用基质范围广且准确度、灵敏度高，在2.50～100 μg/L的浓度范围内喹诺酮类抗生素浓度与峰面积成良好的线性关系( r＞0.99) ; 加标回收率为73.8 %～96.9 % ，RSD%为4.13 %～7.80 %，检出限0.65～0.90 μg/kg，能满足国内食品安全风险监测的要求，检测结果准确可靠，该方法适合大批量样品的日常检测。

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