液相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜中吡虫啉、啶虫脒和氯虫苯甲酰胺残留量

wsz29

2023/08/01
安阳疾控理检队

私聊

液质联用（LCMS）

液相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜中吡虫啉、啶虫脒

和氯虫苯甲酰胺残留量

引言：新烟碱类杀虫剂为昆虫乙酰胆碱受体激动剂，通过与烟碱型的乙酰胆碱受体结合, 使昆虫异常兴奋，全身痉挛麻痹而死，新烟碱类杀虫剂主要以吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、噻虫啉、噻虫胺及呋虫胺为主要代表^[¹^]，具有广谱、高效、低毒、低残留，害虫不易产生抗性，对人畜低毒，对天敌杀伤力小，对鱼毒性较低，对蜜蜂影响小，适用于防治果树、蔬菜等多种作物上的半翅目害虫，用颗粒剂作土壤处理，可防治地下害虫^[²^] 。是继有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类等杀虫剂之后的第四大类杀虫剂^[³^]。氯虫苯甲酰胺是一种对鳞翅目害虫高效、对非靶标生物低毒、对环境友好的新型鱼尼丁受体类杀虫剂，属于新型邻甲酰胺基苯甲酰胺类，是防治小菜蛾的理想药剂^[4]。虽然这三种农药高效安全低毒，但随着在蔬菜种植过程中使用范围和用量逐年增加，不规范或违规使用造成的农药残留问题也不容忽视，目前测定方法主要有液相色谱法^[5-6]、液相色谱-串联质谱法 ^[7-8]，样品前处理方法都需要经过传统固相萃取、浓缩、等步骤，存在操作程序繁琐、易污染、抗干扰差等缺点^[2,5-6]，并且同时测定吡虫啉、啶虫脒和氯虫苯甲酰胺这三种农药的方法还未见报道，本文根据相关文献，研究采用乙腈直接提取、无水硫酸镁脱水、N-丙基乙二胺（PSA）粉末净化、水稀释后液相色谱串联质谱仪同时测定吡虫啉、啶虫脒和氯虫苯甲酰胺的方法，采用基质工作曲线外标法直接定量，应用该方法很好完成了本年度蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留检测任务，本法灵敏、简便高效干扰少，可满足蔬菜中吡虫啉、啶虫脒和氯虫苯甲酰胺农药残留量的准确监测需求。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1样品来源

样品采集自市区超市及农贸市场，以大白菜 (叶菜类)、豇豆 (豆类)为主。

1.1.2 仪器

液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）（美国waters TQ-S）；电子天平（感量0.001g梅特勒AL-204）；均质机（飞利浦 HR2850）；漩涡混匀器（SCILOGEX MX-S）；漩涡振荡器(德国 heidolph Multi Reax)；超声波清洗机（南京先欧仪器制造有限公司 XO-800DTN）；氮吹仪（美国 organomation,N-EVAP-112）；高速冷冻离心机（转速不低于10000r/min）；多功能净化柱：Mycosep^TM226多功能净化柱（ROMER）；微孔滤膜（津腾，0.22μm，混合型）。

1.1.3试剂

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682规定的一级水。甲醇（美国默克公司优级纯）；乙腈（美国默克公司优级纯）；丙酮（美国默克公司优级纯）；甲酸，（中国上海麦克林色谱纯）；甲酸铵，（中国上海麦克林色谱纯）；无水硫酸镁（北京化工厂，分析纯）；氯化钠（北京化工厂，分析纯）；N-丙基乙二胺（PSA）粉末（中国天津博纳艾杰尔）；农药标准品：吡虫啉、啶虫脒、氯虫苯甲酰胺（100.0μg/ml，农业部环境保护科研监测所）；

1.1.4 试剂和农药标准溶液配制：

10 mmol/L甲酸和6 mmol/L甲酸铵缓冲液：准确称量378 mg甲酸铵，吸取0.38 mL甲酸，用水稀释并定容至1 L。

标准储备液（10.0μg/ml）：将单个农药标准溶液100.0μg/ml农药标准品，用甲醇溶解，逐一配制成10μg/ml的单一农药标准储备液，贮存在-20℃以下冰箱中。

混合标准溶液中间液（1 mg/L）：吸取1 mL混合标准中间液（10 mg/L）于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。

基质匹配的工作曲线（2~200 μg/L）：准确吸取混合标准使用液（1 mg/L）2~200 μL，加入0.5 mL空白样品提取液，用水定容到1 mL，混匀，过0.22 μL滤膜后LC-MS/MS测定。

1.2 方法

1.2.1试样制备

1.2.1.1取样

取蔬菜样品可食部分约0.5kg，将其切碎，充分混匀放入均质机粉碎，制成待测样。放入分装容器中，于-20℃条件下保存，待提取。

1.2.1.2 提取

准确称取10 g均质过的样品（精确至0.01 g）于 50ml离心管内，加入10 mL乙腈，混匀后漩涡振荡器提取30 min。加入1.0 g氯化钠和5.0 g无水硫酸镁，立即涡旋10s后，8000 rpm离心5 min，上清液备用。

1.2.1.3 净化：

吸取蔬菜提取液约1.5 mL于事先加有无水硫酸镁150 mg和PSA 75 mg的5 mL塑料离心管中，涡流混匀10 s后于8000 rpm离心5 min。取上清液0.5 mL，加水0.5 mL，混匀，过0.22 μL滤膜后LC-MS/MS测定。

1.2.2 仪器条件

1.2.2.1色谱条件见表1

表1 液相色谱条件

色谱柱	C₁₈，150 mm x 2.1 mm，粒径2.5 μm
柱温	40°C
流速	0.3 mL/min
进样量	2 mL
样品池温度	15°C
流动相A 流动相B	乙腈 10 mmol/L甲酸和6 mmol/L甲酸铵缓冲液
梯度洗脱程序	见表2

表2 梯度洗脱表

时间（min）	流动相A（%）	流动相B（%）
0.00	20	80
5.0	90	10
7.0	90	10
7.5	20	80
8.0	20	80

1.2.2.2质谱条件见表3

表3 质谱条件

电离方式	ESI
扫描方式	正离子扫描
监测方式	多反应监测
电喷雾电压	3.2kV
离子源温度	150°C
脱溶剂其流量	800L/H
脱溶剂其温度	550°C
保留时间、监测离子对	见表4

表4 3种农药保留时间及定性定量离子和碰撞能量

农药名称	保留时间	定量离子对(m/z)	碰撞能（eV）	定性离子对(m/z)	碰撞能（eV）
吡虫啉	1.33	256/175.2	17	256/209	14
啶虫脒	1.55	223.1/126.1	22	223.1/56.1	15
氯虫苯甲酰胺	3.15	484/453	18	484/286	16

在优化后的仪器条件，3种化合物定量、定性离子均有较好响应，总离子流图及定量、定性离子对图见图1

图1 3种化合物总离子流图及定量、定性离子对图

1.2.3 基质匹配的工作曲线绘制及试样的测定：

根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的基质标准工作液进行色谱分析。准确吸取混合标准使用液（1 mg/L）10、20、50、100、200μL，加入0.5 mL空白样品提取液，用初始流动相（20%流动相A：80%流动相B）定容至1 mL，混匀，过0.22 μL滤膜后配制成系列基质标准溶液，浓度分别为：10、20、50、100、200 μg/L。分别将系列基质标准溶液和处理好的试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，记录总离子流图和质谱图及被测组分的峰面积。以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制工作曲线，得到基质标准曲线回归方程，基质标准工作液和样液待测物的响应值均应在仪器线性响应值范围内。

2 结果与分析

2.1 样品提取剂选择

烟碱类农药及氯虫苯甲酰胺属于极性物质，易溶于甲醇、乙腈等，本实验以甲醇、乙腈、乙酸乙酯为溶剂进行了提取剂的优化。实验结果表明，用乙腈提取样品，农药的回收率大于 82.2%；用甲醇提取样品，氯虫苯甲酰胺的回收率只有68.7%，用乙酸乙酯提取样品，样品颜色较深，杂质较多，基质效应明显，农药的回收率均小于50.7%。因此，本实验选用乙腈为提取剂。为了更好地保证乙腈渗入样品体内，对于含水量少的样品，如豆类，可先加少量水浸润样品，使其恢复到鲜品状态，再均质，可提高提取效率。

2.2样品前处理净化方法的选择

不同蔬菜中样品基质复杂，因此提取后还需净化才能进行样品的检测分析，由于烟碱类农药及氯虫苯甲酰胺属于极性物质，易与样品基质中的高极性化合物在质谱电喷雾电离源处发生离子化抑制现象而导致回收率偏低，本文选择了QuEChERS净化方法，对比不同量的PSA填料，发现PSA填料大于PSA 70mg时加标回收率理想；安全起见，选用PSA75 mg，作为净化粉末，尽可能去除样品基质中的杂质，净化效果好，能够满足3种农药回收率测定的要求。

2.3基质效应

采用 LC-MS/MS 进行残留测定时应尽量避免基质效应，同时基质效应也可反映净化效果。配制吡虫啉、啶虫脒、氯虫苯甲酰胺的系列浓度基质标准溶液，同时配制相应的溶剂标准溶液，以基质标准线性回归方程的斜率与溶剂标准液的斜率比值评判基质效应的程度：比值＞1，表明存在基质增强效应；比值＜1，存在基质抑制效应；比值越接近1，则基质效应越小；当比值远离 1，表明存在明显的基质效应，必要时需进一步净化。本报告斜率比值为0.65，说明样品基质抑制效应明显，故不可使用溶剂标准溶液，故本报告选用基质标准溶液绘制基质工作曲线，增加方法测定的准确度和精密度。

2.4质谱和色谱条件优化

分别配制浓度为0.5mg/L 3种化合物混合标准溶液溶进行质谱条件优化。采用ESI +和ESI－扫描模式，分别选择各准分子离子［M+H]⁺和［M－H]^－为母离子，进行二级质谱优化，参数包括碰撞能量、锥孔电压等，根据方法智能开发报告，3种化合物在ESI+模式下可以优化出更好的灵敏度，故采用ESI+模式，质谱条件见1.2.2。

2.5 线性范围、定量限、精密度和准确度

在1.2.2的仪器条件下，配制吡虫啉、啶虫脒、氯虫苯甲酰胺的系列基质标准溶液，经 LC-MS/MS 测定后，以化合物的峰面积和浓度做图，绘制标准曲线。3种化合物在 10μg/L~200μg/L质量浓度范围内线性关系良好，回归方程、相关系数 r，见表6。

以信噪比（S/N）为3和10时色谱响应值对应的浓度水平为检测限(LOD)和定量限(LOQ)。以10 g取样量、提取溶剂10mL、再用水稀释1倍时计算，具体结果见表6。

以空白样品试验，分别加入3种农药化合物，使得目标化合物在样品中的曲线浓度分别为 10、50、100 μg/L，按上述方法对样品进行处理和测定，平行重复6份，结果表明所有目标物的添加平均回收率在86.3 %~93.8 %之间，相对标准偏差RSD在1.7~8.4 %之间，方法具有较好的回收率和重现性。

表6 吡虫啉、啶虫脒、氯虫苯甲酰胺检出限和定量限

组分	回归方程	相关系数r	检出限（mg/kg）	定量限（mg/kg）
吡虫啉	Y=23268.2X+2125.9	0.9979	0.003	0.01
啶虫脒	Y=62189.2X+8026.8	0.9970	0.003	0.01
氯虫苯甲酰胺	Y=161254X-6108.1	0.9993	0.003	0.01

3 结论

本文根据蔬菜中吡虫啉、啶虫脒、氯虫苯甲酰胺残留量的特点，结合相关文献，试验对比了多种提取剂和净化方法，优选了提取溶剂，改进简化了前处理净化方法，优化了液相色谱-质谱的仪器条件，建立蔬菜中吡虫啉、啶虫脒、和氯虫苯甲酰胺残留量同时检测的分析方法，采用乙腈浸泡直接提取、无水硫酸镁脱水、QuEChERS净化方法净化、水稀释后液相色谱串联质谱仪测定方法，该方法采用前处理的方法简单高效便捷，采用基质工作曲线，准确度高，方法具有较好回收率和精密度，运用本方法对本市30份蔬菜样品进行了测定，较好完成了检测任务，该法能够满足蔬菜样品中吡虫啉、啶虫脒、和氯虫苯甲酰胺残留量的分析测定要求。

4 参考文献

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