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实时定量PCR技术原理及标记方法详解

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2023/10/09

生命科学仪器综合讨论

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）简称qPCR，是一种在DNA扩增体系中加入荧光基团，通过聚合酶链式反应（PCR）循环实现荧光信号的积累，从而实现检测每次PCR循环后产物总量的一种方法，是核酸检测和定量分析的“金标准”。

技术原理

实时荧光定量PCR根据所使用的荧光标记方法可分为两种：荧光染料（SYBR Green I染料为主）和荧光探针（TaqMan探针）。

①SYBR Green I染料法

SYBR Green I染料是一种结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。这种染料在反应体系中处于游离状态时，发出的荧光极其微弱，但当其与DNA双链结合的时候，荧光信号就会被放大，从而被仪器所检测。在PCR实验中，染料的结合量与DNA的浓度呈现正比关系，所以我们可以通过检测荧光信号的强度来反映PCR体系中DNA的浓度。

优点：可用于检测任何双链DNA序列的扩增，无需单独设计探针，操作简单，成本较低。

②TaqMan探针法

TaqMan荧光探针是进行荧光检测的另一种方法。TaqMan荧光探针是由5’端的荧光报告基团、3‘端的荧光淬灭基团和靶基因特异性结合的序列构成。当探针在反应体系中处于游离状态时，荧光报告基团的信号会被荧光淬灭基团所吸收。但当PCR进行到退火、延伸阶段时，DNA聚合酶会将荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而发出荧光，因此探针法也可以通过检测荧光信号强度来反应PCR体系中DNA的浓度。

优点：荧光探针只与目的序列结合，具有良好的特异性，无需实验优化；不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，兼容多重反应。

常见术语：

CT值：C代表Cycle，T代表Threshold，即指qPCR在扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。

惰性参比染料（ROX）：用作荧光信号标准化内部参照，可以逐孔校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。

扩增曲线：Amplification curve ，随着PCR反应的进行，荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强，通过荧光强度来检测扩增产物的变化。

扩增效率：一个DNA分子扩增为2个DNA分子，这种情况下的扩增效率为100%。实际上会出现偏高和偏低的情况，90-110%之间。

溶解曲线：Melting curve，是指扩增反应结束后，对双链DNA进行升温处理，此时，DNA双链逐渐解开，染料脱落，荧光值下降，荧光值随温度变化的曲线即“溶解曲线”，可用来判断体系中是否含有引物二聚体和非特异性扩增。

NTC：无模板对照（No template control），是指扩增反应中，模板通常用水来代替，用于检测试剂污染或外源DNA造成的污染。

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