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实时定量PCR技术原理及标记方法详解

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    2023/10/09
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生命科学仪器综合讨论

  • 实时荧光定量PCRQuantitative Real-time PCR)简称qPCR,是一种在DNA扩增体系中加入荧光基团,通过聚合酶链式反应(PCR)循环实现荧光信号的积累,从而实现检测每次PCR循环后产物总量的一种方法,是核酸检测和定量分析的“金标准”。



    技术原理



    实时荧光定量PCR根据所使用的荧光标记方法可分为两种:荧光染料(SYBR Green I染料为主)和荧光探针(TaqMan探针)。



    SYBR Green I染料法



    SYBR Green I染料是一种结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。这种染料在反应体系中处于游离状态时,发出的荧光极其微弱,但当其与DNA双链结合的时候,荧光信号就会被放大,从而被仪器所检测。在PCR实验中,染料的结合量与DNA的浓度呈现正比关系,所以我们可以通过检测荧光信号的强度来反映PCR体系中DNA的浓度。



    优点:可用于检测任何双链DNA序列的扩增,无需单独设计探针,操作简单,成本较低。



    TaqMan探针法



    TaqMan荧光探针是进行荧光检测的另一种方法。TaqMan荧光探针是由5’端的荧光报告基团、3‘端的荧光淬灭基团和靶基因特异性结合的序列构成。当探针在反应体系中处于游离状态时,荧光报告基团的信号会被荧光淬灭基团所吸收。但当PCR进行到退火、延伸阶段时,DNA聚合酶会将荧光报告基团和荧光淬灭基团分离,从而发出荧光,因此探针法也可以通过检测荧光信号强度来反应PCR体系中DNA的浓度。



    优点:荧光探针只与目的序列结合,具有良好的特异性,无需实验优化;不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针,兼容多重反应。



    常见术语:



    CT值:C代表CycleT代表Threshold,即指qPCR在扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。



    惰性参比染料(ROX):用作荧光信号标准化内部参照,可以逐孔校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。



    扩增曲线:Amplification curve ,随着PCR反应的进行,荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强,通过荧光强度来检测扩增产物的变化。



    扩增效率:一个DNA分子扩增为2DNA分子,这种情况下的扩增效率为100%。实际上会出现偏高和偏低的情况,90-110%之间。



    溶解曲线:Melting curve,是指扩增反应结束后,对双链DNA进行升温处理,此时,DNA双链逐渐解开,染料脱落,荧光值下降,荧光值随温度变化的曲线即“溶解曲线”,可用来判断体系中是否含有引物二聚体和非特异性扩增。



    NTC:无模板对照(No template control),是指扩增反应中,模板通常用水来代替,用于检测试剂污染或外源DNA造成的污染。



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