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浅谈口蹄疫A型抗体水平检测流程

Ins_bde21326

2023/10/25
哈罗德战队

私聊

其他仪器综合讨论

浅谈口蹄疫A型抗体水平检测流程

目标	监测口蹄疫A型抗体水平及疫苗的保护效力从而制定合理的免疫程序
个人防护装备	一次性口罩，一次性防护服，一次性丁腈手套，一次性鞋套
操作时间	免疫口蹄疫疫苗后21-28天
复审
健康安全环境与食品质量安全经理签字
牧场经理签字
总经理签字

请对照图片检查自己是否按要求佩戴了劳动保护用品。

版本历史

	版本	生效日期	主要变化
01
02
03
04

健康安全关键风险点和食品安全关键控制点

（本章节的目的：当员工执行此SOP时，提高员工关于关键风险点和食品安全关键控制点的意识）

	序号	健康安全关键风险点	食品安全关键控制点
1	化学品！	无
2
3

程序

	步骤	行动	关键点
1	血清准备全血样品2000rpm离心5分钟。立即检测或者-20℃（最好-80℃）保存并尽快检测。	须避免人员皮肤直接接触血清。严格穿戴好PPE。
2	口蹄疫抗体A型检测试剂盒组分2-8℃冷藏保存，实验前取出恢复到室温（18℃-25℃）。将试剂取出，轻轻涡旋或者震荡混匀。	冬季温度低时，切勿将反应板直接放到冰冷的桌面上，应有泡沫作为缓冲。
3	磷酸盐-吐温缓冲液（PBST）使用前，将25倍PBST浓缩液用无离子水或蒸馏水稀释成1倍PBST（浓缩液与水体积比为1:24）。	每板约需600ml，即600ml的去离子水中加入25ml的25倍PBST浓缩液。
4	仪器准备打开酶标仪预热20分钟，打开洗板机选择DailyRaise 程序进行管路清洗。
操作步骤
5	抗原抗体反应（以20份/板为例）首先在抗原抗体反应板上加入PBST，以进行抗体稀释。在A1~A10以及E1~E10每孔加入75uL PBST；其余（B1~B10；C1~C10；D1~D10；F1~F10；G1~G10；H1~H10；第11列全部和第12列A、B孔）加入40 uL PBST。加入待检血清和对照血清：在A1~A10，E1~E10孔加入5uL待检血清，混匀后，血清浓度为1:16，分别吸取40uL到B1~B10及F1~F10，血清浓度从1:16开始做连续2倍稀释至1:128，最后一行（D1~10，H1~10）吸取40uL混合液后弃掉。第11 列为阳性对照孔，直接吸取40 uL的阳性血清作2倍稀释至1:2048；第12列A、B孔为阴性对照孔，吸取40 uL的阴性血清对倍稀释到B孔。见表1。然后每孔加入40 uL用PBST稀释到工作浓度的口蹄疫病毒抗原；病毒抗原对照孔（E12, F12, G12,H12）各加80 uL。振荡混匀，封板，4℃湿盒过夜或37℃震荡孵育90min。（见表2）	口蹄疫A型病毒抗原工作浓度 1:3为例，具体抗原浓度须按照试剂盒说明书进行配制, 每板需要工作浓度的抗原5ml，通常多配出1-2ml，为6ml，即6mlPBST加入2ml的病毒抗原液；阳性对照血清已稀释浓度为1:8；口蹄疫A型病毒抗原放于-80℃更有利于储存；湿盒内的反应板也要有湿纱布覆盖； U型96孔板为重复利用板，可以刷干净后，用去离子浸泡晾干备用，可以用普通12孔板条代替。避免人员皮肤直接接触血清溶液。废弃液存放废弃槽内，由专业资质机构回收处理。
6	将抗原抗体混合液从抗原抗体反应板上按次序转移至酶标板上的相应孔，50uL/孔，封板，37℃孵育60min。
7	洗板5次，甩干，拍净。
8	按50uL/孔加入口蹄疫A型豚鼠抗体工作液（红色），封板，37℃孵育30min。	口蹄疫A型豚鼠抗体已稀释为工作浓度。
9	洗板5次，方法同步骤7。
10	按50uL/孔加入兔抗鼠IgG-HRP抗体工作液（蓝色），封板，37℃孵育30min。	兔抗豚鼠血清IgG-HRP已稀释为工作浓度。
11	洗板5次，方法同步骤7。
12	将TMB底物A溶液和B溶液以1：1比例混合均匀，加入混合后的底物溶液50uL/孔，37℃孵育15min；显色反应结束后，每孔加50uL终止液终止反应，在酶标仪上读取OD_450nm值。	操作者须熟练掌握终止液和双氧水的 MSDS，培训合格后方可上岗；严格穿戴好PPE-实验服、一次性丁腈手套、化学品防护眼镜、一次性口罩和防护面罩。
13	结果判定判定标准：每块板设置4个病毒抗原对照，病毒抗原对照的OD_450nm或OD_450nm值应在1.0 以上；阳性对照抗体效价在1:1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜1:8，试验结果才有效。
14	血清抗体效价的判定：被检血清OD_450nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于或等于临界值的孔为阳性孔。以阳性孔的最高稀释倍数为被检血清的抗体效价。若临界值处于2个稀释孔OD_450nm值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。	临界值：弃去最高值和最低值，计算剩余2孔的平均OD_450nm值，再除以2，即50%对照值，该值为临界值。
15	最终结果判定：单个血清样品：≥1:128判为阳性，1:64—128时，判为可疑，≤1:64时判为阴性群体：70%的被检血清的抗体效价大于1:128即可判为疫苗有保护效力。	抗体效价≥1:128 ，即疫苗保护效力在99%以上；可疑血清样品可以复测，复测抗体效价≥1:128,判为阳性，小于1:128判为阴性。
16	废弃物回收废弃物置于医疗垃圾废弃物桶统一回收。

附件：

实验室操作规范

奶牛口蹄疫A型抗体水平检测

样品名称：

牧场：

样品种类：

取样日期：

取样人：

检测时间：

试剂盒种类：口蹄疫A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒

试剂盒批号：

有效期：

检测人：

复核人

待检样品说明（或检验目的）：检测牛只免疫口蹄疫疫苗21-28d后，血清中口蹄疫A型病毒抗体含量

加样顺序：

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A
B
C
D
E
F
G
H

操作过程记录：

Ⅰ 操作前准备

1 所有试剂盒组分是否回温充分（是/否），回温温度（ ℃），回温时间；

2 记录实验室温度（ ℃）；

3 确认孵育反应温度（ ℃和/或 ℃ ）；如为37℃，请提前打开温箱；

4 确认仪器（酶标仪、洗板机等）的工作状态。

Ⅱ 试剂准备

1 洗涤液的配制：

（）毫升浓缩液 + （）毫升纯净水

2 样品的稀释

第一步：（）微升血清+（）微升样品稀释液

第二步：（）微升血清+（）微升样品稀释液（或不需要）

第三步：（）微升血清+（）微升样品稀释液（或不需要）

3 对照是否需要稀释（是/否），如需稀释，稀释比例（）

4 酶标抗体是否需要稀释（是/否），如需稀释，短期孵育模式稀释比例（　　）；过夜孵育模式稀释比例（）

5 底物溶液配置：使用前将底物A和底物B按1：1体积混合，现用现配。

Ⅲ 操作步骤

（1）在U型反应班上加入样品稀释液微升；（2）加入对照及样品（对照：＿微升；样品：＿微升），轻弹混匀此时样本稀释度为，并按2倍比例梯度依次稀释至；（3）加入病毒抗原微升（4）第一次孵育 ℃ （时间：＿：＿至＿：＿）；（5）取抗原抗体混合液从U型反应板转移至已包被口蹄疫A型兔抗的ELISA（6）第二次孵育 ℃ （时间：＿：＿至＿：＿）；（4）第一次洗涤（次数：＿次；体积：＿微升）；（7）加入口蹄疫A型兔抗豚鼠抗体工作溶液微升；（8）第三次孵育 ℃ （时间：＿：＿至＿：＿）；（9）第二次洗涤（次数：＿次；体积：＿微升）；（10）加入兔抗豚鼠IgG-HRP酶标二抗工作液（＿微升）；（11）第四次孵育 ℃（时间：：＿至＿：＿）；（12）第三次洗涤（次数：＿次；体积：＿微升）；（13）加入底物（＿微升）；（14）显色（时间：＿：＿至＿：＿）；（15）加入终止液终止反应（＿微升）。

IV酶标仪450nm读数结果：

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A
B
C
D
E
F
G
H

V结果判定：

1.实验认可标准：4个孔病毒抗原对照OD450nm均大于1.0（）；阳性对照抗体效价（），是否在1:512-1:2048之间（）；阴性对照血清抗体效价（），是否<1:8( )。

2.血清抗体效价判定：

抗原对照临界值（50%对照值）= ；

阴性孔为被检样品OD450nm>临界值；阳性孔为被检样品OD450nm<临界值;

若临界值与稀释倍数最高阳性孔的OD450nm值相同，则以被检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于两个稀释孔之间OD450nm之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。

3.结果判定

抗体效价大于或等于1:128为口蹄疫A型抗体阳性；1:64-1:128时，判为可疑；<1:64时判为阴性。可疑血清样本重新检测。

1. 双氧水应急处理

急救措施

皮肤接触：脱去污染的衣着，用大量流动清水冲洗。

眼睛接触：立即提起眼睑，用大量流动清水或生理盐水彻底冲洗至少15分钟。就医。

吸入：迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难，给输氧。如呼吸停止，立即进行人工呼吸。就医。

食入：饮足量温水，催吐。就医。

消防措施

危险特性：爆炸性强氧化剂。过氧化氢本身不燃，但能与可燃物反应放出大量热量和氧气而引起着火爆炸。过氧化氢在pH值为3.5～4.5时最稳定，在碱性溶液中极易分解，在遇强光，特别是短波射线照射时也能发生分解。当加热到 100℃以上时，开始急剧分解。它与许多有机物如糖、淀粉、醇类、石油产品等形成爆炸性混合物，在撞击、受热或电火花作用下能发生爆炸。过氧化氢与许多无机化合物或杂质接触后会迅速分解而导致爆炸，放出大量的热量、氧和水蒸气。大多数重金属（如铁、铜、银、铅、汞、锌、钴、镍、铬、锰等）及其氧化物和盐类都是活性催化剂，尘土、香烟灰、碳粉、铁锈等也能加速分解。浓度超过74％的过氧化氢，在具有适当的点火源或温度的密闭容器中，能产生气相爆炸。

有害燃烧产物：氧气、水。

灭火方法：消防人员必须穿全身防火防毒服，在上风向灭火。尽可能将容器从火场移至空旷处。喷水保持火场容器冷却，直至灭火结束。处在火场中的容器若已变色或从安全泄压装置中产生声音，必须马上撤离。灭火剂：水、雾状水、干粉、砂土。

泄漏应急处理

应急处理：迅速撤离泄漏污染区人员至安全区，并进行隔离，严格限制出入。建议应急处理人员戴自给正压式呼吸器，穿防毒服。尽可能切断泄漏源。防止流入下水道、排洪沟等限制性空间。小量泄漏：用砂土、蛭石或其它惰性材料吸收。也可以用大量水冲洗，洗水稀释后放入废水系统。大量泄漏：构筑围堤或挖坑收容。喷雾状水冷却和稀释蒸汽、保护现场人员、把泄漏物稀释成不燃物。用泵转移至槽车或专用收集器内，回收或运至废物处理场所处置。

2.终止液应急处理

急救措施

食入：请勿催吐。若患者清醒，让其立刻饮用大量或奶以稀释硫酸。若患者不清醒，请勿给予任何口服物品。立即就医。

吸入：如果接触量很小，吸入风险不大。但是如果操作者身体有恙，需将其立刻带到空气清新处。若呼吸困难，立刻就医并输氧。如果呼吸停止，做人工呼吸。立刻就医。

皮肤接触：立即脱去被污染衣着，用大量流动清水冲洗，至少15 分钟。在下次使用前将污染衣物清洗干净。用2%的小苏打溶液中和皮肤上多余的酸。立刻就医。

眼睛接触：提起眼睑，立刻用大量流动清水冲洗至少15 分钟。就医。

消防措施

灭火剂：硫酸溶液不易燃。遇水稀释后发生强烈的放热反应（释放氢气），如果量小，不会产生太大影响。须使用泡沫，二氧化碳或干化学品等灭火剂。用水喷洒给着火容器降温。

非常规火灾和爆炸：遇火时，可能产生有毒烟雾（硫氧化物）。与常规金属接触后可能产生氢，并与空气接触后生成易燃混合物。

特殊消防程序及设备：遇火灾时，穿戴自给式呼吸器和保护眼睛和皮肤的装备。

泄漏应急处理措施

产品包装的泄漏概率较低。一旦泄漏，应用碱中和（碳酸钠，石灰粉），然后用惰性材料吸收（蛭石，沙子，土）。操作时按第8步要求穿戴PPE。清洗并确保污染区域通风。

防止液体流入下水道或水渠。