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淡水鱼中喹诺酮兽药残留的超高效液相色谱串联质谱测定法

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2023/10/31
安阳疾控理检队

私聊

液质联用（LCMS）

淡水鱼中喹诺酮兽药残留的超高效

液相色谱串联质谱测定法

1立题背景与目的意义

兽药残留是指食用动物在食用兽药后，蓄积或残存在动物组织器官中或进入泌乳动物乳汁或禽蛋中的药物原形，代谢物和杂质等。我国是畜牧养殖大国，动物源性食品安全是食品安全的重要组成部分，兽药残留是影响动物源性食品安全的主要因素之一。兽药残留来源：违法使用禁药、淘汰药、人用药、原料药；兽药质量不合格或不稳定、超剂量使用、改变用药对象、改变给药途径改变给药间隔、次数；屠宰前为掩蔽症状用药，不遵守休药期；药物间的互相影响；饲料污染等。危害包括中毒、过敏、“三致”、肠道菌群失调、长期毒性作用、耐药和环境问题。中国从1999年开始兽药残留监测工作。食品中兽药最大残留限量(GB31650-2019)涉及兽药267种，包括允许用于食品动物但不需要制定残留限量标准、允许用于食品动物但需要制定残留限量标准，允许用于食品动物但不得在动物性食品中检出。兽药残留特点是复杂、隐蔽、微量、蓄积。我国是兽用化学制剂使用量最大的国家之一，其中抗菌药物使用量超过化学制剂总用量的70%，约三分之二的抗菌药物用作饲料药物添加剂。我国每年约有10万吨抗菌药物用于养殖业！

喹诺酮(Quinolones,QNs)以喹啉母核为基本结构单元的一类广谱抗生素为吡啶酮酸类化合物。1962年，第一个喹诺酮药物诞生，抗菌活性高，价格较低。喹诺酮类抗生素(QNs)大量用于人类和动物的医疗，也作为饲料添加剂，促进动物生长，使用后多以药物原形或代谢物排出，尤其近年来随着QNs在动物养殖业中的大量使用，造成水环境污染和土壤环境污染问题，动物源性食品中出现喹诺酮类药物残留的风险日趋增加，所带来的动物性食品抗生素残留污染问题已引起广泛关注，如长期食用喹诺酮类抗生素超标的食物会影响儿童骨骼发育并产生皮肤及神经毒性，目前，联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、美国食品和药物管理局(food and drug administration, FDA)、欧盟与日本都对喹诺酮类药物制定了最大残留限量（MRLs ），我国也对恩诺沙星、达氟沙星等喹诺酮类抗生素做出了限量规定^[8]。达氟沙星、恩诺沙星等MRLs 均为 100μg/kg。农业部2292号公告停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星，但滥用普遍, 需要建立可靠的方法进行监测、评估与控制。

鱼肉作为大众消费食品，其安全性备受关注。往年做喹诺酮基质都是猪肉、鸡肉及鸡蛋等畜禽制品，随着食品风险监测不断完善，喹诺酮食品检测类别也在不断增加，开展水产品基质中喹诺酮兽药残留检测，食品品种增加淡水鱼等多种鱼类类别，展现出一个新的挑战，因此需要我们设法研究建立淡水鱼中的喹诺酮残留量检测方法。

喹诺酮类兽药残留的检验方法^[9-14]有酶联免疫分析法、毛细管电泳法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。文献报道的样品前处理大多采用液液萃取、固相萃取、免疫亲和萃取、分子印迹技术、凝胶渗透色谱。大多具有有机溶剂消耗量大、操作复杂、费时等缺点，不适用于大量样品的快速筛查。如免疫亲和萃取分离纯化效率高、有机溶剂用量少，但用于兽残产品很少；固相萃取，多用于农残检验，适用于含水量>60的基质，尤其对操作人员、操作条件、操作试剂和材料要求较高，如操作不当，容易造成回收率降低；QuEChERS是近年来应用日趋广泛的分散固相萃取样品前处理技术^[19]，具有有机溶剂用量少、操作简单、便捷、成本低廉等特点，在农药和兽药残留检测方面得到广泛引用，可满足日常检测需要，更适合快速筛查工作。

随着多残留检测的需要, 有文献报道多种药物残留同时检测的分析方法，样品大多为猪肉、蜂蜜及蜂花粉、禽肉、蔬菜、乳制品等食品基质以及饲料、养殖水体。但目前利用QuEChERS 方法测定鱼肉中的喹诺酮提取药物残留的相关报道还较少。本研究在总结本实验室真菌毒素检测经验并查阅相关文献信息基础上^[20]，建立了一种适用于淡水鱼中喹诺酮兽药残大批量快速检测方法，样品经酸性乙腈水溶液提取，C18固相萃取填料净化，利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS-MS)的多反应监测模式（MRM），基质加标校正曲线外标法定量，包括恩诺沙星（Enrofloxacin）、诺氟沙星(Norfloxacin) 、培氟沙星(Pefloxacin)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、氧氟沙星(Oflaxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin，在实际样品检测中得到较好的应用，并提供了淡水鱼兽残相关信息，以期为淡水鱼中喹诺酮类抗生素的检测分析和健康风险评价提供更可靠的依据。

2材料与方法

2.1材料

2.1.1样品来源

按照监测计划要求并根据居民的饮食消费情况，采集流通环节市售淡水鱼样品共30份，采样情况见表 1。

表 1淡水鱼样品采样情况

食品种类	食品类别	样品份数
淡水鱼	鲤鱼	8
	鲫鱼	6
	罗非鱼	6
	草鱼	3
	黑鱼	1
	河鲈鱼	2
	鲟鱼	2
	鲶鱼	2

2.1.2 主要仪器与试剂

TQ-S 超高效液相色谱-串联质谱仪 ( 美国Waters) ，配有电喷雾离子源（ESI）（美国waters TQ-S）；电子天平（感量0.001g 赛多利斯BT-223S）；均质机（飞利浦 HR2850）；漩涡混匀器（SCILOGEX MX-S）；漩涡振荡器（德国 heidolph Multi Reax）；高速冷冻离心机（蜀科 TGL-16 ）；滤膜（0.22 μm，美国 Millipore)；

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682规定的一级水。乙腈（美国默克公司色谱纯）；甲酸（中国上海麦克林色谱纯）；C18吸附剂（中国天津博纳艾杰尔）；喹诺酮类药物标准物质：恩诺沙星（Enrofloxacin, CAS: 93106-60-6）、诺氟沙星 (Norfloxacin, CAS: 70458-96-7) 、培氟沙星(Pefloxacin, CAS: 6159-55-3)、环丙沙星(Ciprofloxacin, CAS: 85721-33-1)、氧氟沙星(Oflaxacin, CAS: 82419-36-1)、洛美沙星(Lomefloxacin, CAS: 98079-51-7)。

2.2方法

2.2.1标准溶液的制备

标准工作液：分别取各喹诺酮类药物标准品100μL 至 10.0mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成混合标准工作液。各组分浓度为 10 μg/mL。此标准工作液 4℃保存，可保存 3 个月。准确移取适量混合标准工作液，用空白基质提取液配制成混合标准系列，各组分浓度分别为：1.0μg/L、2.5μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L 和 100μg/L。

2.2.2样品处理

提取：称取均质试样 2g（精确到 0.01 g）于 50 mL 塑料离心管内，加入 10 mL 含乙腈-水-冰乙酸（84∶15∶1，v/v/v），混匀后涡旋振荡提取20 min，以 9000 r/min 离心 5 min，取上清液备用。净化：另取一 15 mL 离心管，加入 250 mg C18 吸附剂，再移入前述上清液 6 mL，震荡 1 min，9000 r/min 离心 5 min，取上清液 1 mL 并用 1 mL 0.1%甲酸水溶液稀释后上机测定。

2.2.3仪器条件

色谱:流动相：A（40% 甲醇-乙腈溶液）；B（0.1%甲酸水溶液）；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC^TMBEH C18（(100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.2mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。梯度洗脱程序见表2。

表2 6种喹诺酮梯度条件

时间（min）	甲醇/乙腈（%）	0.1%甲酸水（%）
0	10	90
3	30	70
6	80	20
6.5	100	0
7	100	0
7.5	10	90
8	10	90

质谱: 电喷雾电离正离子模式（ESI⁺），离子源温度为 110 ℃，毛细管电压2.0 kV，脱溶剂气温度为 350 ℃ ，脱溶剂气流速为 500 L / h，电子倍增电压：650 V，碰撞室压力：0.28 Pa，多反应监测模式(MRM)。其他质谱条件见表3。

表3 6 种喹喏酮的主要参考质谱参数

化合物名称	母离子（m/z）	子离子（m/z）	碰撞能量（eV）	锥孔电压（V）	保留时间（min）
培氟沙星	334.3	290.3*/233.2	17/25	38	2.56
氧氟沙星	362.2	318.3*/261.2	18/27	38	2.53
诺氟沙星	320.3	302.3*276.3	19/17	50	2.53
环丙沙星	332.2	314.3*/288.3	19/17	36	2.62
恩诺沙星	360.3	316.4*/342.3	19/23	38	2.78
洛美沙星	352.3	265.2*/308.3	23/17	36	2.74

注：*为定量离子

3结果

3.1质谱条件的选择及优化

经过智能优化程序确定各毒素的母离子和子离子参数，按照欧盟母离子识别点数为1、2个子离子各为1.5判断要求，6种化合物离子质谱参数见表 2；通过对质谱参数的优化，获得理想的最低检出限。图1是6种喹诺酮混合标准溶液（MRM）色谱图。

图1 6种喹诺酮混合标准溶液（MRM）色谱图

3.2回收率与精密度

分别选取鱼肉空白样，加入不同浓度水平的混合标准溶液，配制成低中高三个浓度水平的加标样品，每个加标样品进行6次平行试验，加标浓度、回收率以及相对标准偏差(RSD)见表4。加标回收率在96.8%～102.8%之间，RSD为2.3%～5.0%。

表4 6种喹喏酮的回收率和精密度实验（n=6）

化合物名称	加标水平 (μg/mL)	测定值 (μg/mL)	回收率（%)	RSD (%)
	4.00	3.93	98.2	2.3
培氟沙星	16.0	15.9	99.3	4.9
	60.0	60.9	101.5	4.1
	4.00	3.87	96.8	4.0
氧氟沙星	16.0	15.6	97.9	3.9
	60.0	59.9	99.8	4.4
	4.00	3.96	99.0	4.6
诺氟沙星	16.0	15.8	98.8	4.7
	60.0	60.3	100.5	4.2
	4.00	4.11	102.8	4.7
环丙沙星	16.0	15.8	98.8	4.9
	60.0	60.4	100.7	5.0
	4.00	3.94	98.5	2.7
恩诺沙星	16.0	15.9	99.4	3.9
	60.0	59.7	99.5	3.9
	4.00	3.99	99.8	4.4
洛美沙星	16.0	15.7	98.1	3.6
	60.0	59.6	99.3	4.1

3.3线性范围、检出限和定量限

6种待测物在0.5～100μg/kg线性范围内线性关系良好，r 均大于 0.9990；选取鱼肉空白样分别加入适量6种喹诺酮混合标准溶液，以信噪比(S/N)为3计算方法检出限为3.0 μg/kg，以信噪比(S/N)为10计算方法定量限为10 μg/kg，结果见表5。

表5 6种喹诺酮兽残相关系数、检出限及定量限

化合物名称	线性范围（μg/ml）	相关系数 r	检出限 (μg/ml)	定量限 (μg/ml)
培氟沙星	0.5～100	0.9996	3.0	10
氧氟沙星	0.5～100	0.9991	3.0	10
诺氟沙星	0.5～100	0.9995	3.0	10
环丙沙星	0.5～100	0.9990	3.0	10
恩诺沙星	0.5～100	0.9999	3.0	10
洛美沙星	0.5～100	0.9995	3.0	10

3.4方法应用

3.4.1喹诺酮残留情况

采用优化后方法对30份淡水鱼进行检测，检出喹诺酮2种，分别为恩诺沙星和环丙沙星,检出率分别46.7%(14/30)和6.7%(2/30)，检出范围分别为 4.8μg/kg ～ 56.0 μg/kg和8.95μg/kg ～9.10 μg/kg，其余4种均未检出。共检出14份阳性样品，其中有2份样品鲟鱼和鲇鱼同时检出2种喹诺酮兽残。按照我国食品中恩诺沙星兽药最大残留限量为100 μg/kg的标准[9]，样品中恩诺沙星有检出但均未超标，环丙沙星国标目前尚无限量标准。阳性样品图见图2，结果见表6。

图2 恩诺沙星、环丙沙星检出阳性样品图

表6 淡水鱼中各食品类别喹诺酮检测结果（μg/kg）
污染物	食品类别	样品数	平均值	P50	最大值	检出率(%)	超标率(%)
恩诺沙星	鲤鱼	8	11.4	6.95	51.6	50.0(4/8)	0
	鲫鱼	6	3.14	1.5	12.3	33.3(2/6)	0
	罗非鱼	6	2.3	1.5	6.6	16.7(1/6)	0
	草鱼	3	2.8	1.5	5.3	33.3(1/3)	0
	黑鱼	1	10.7	10.7	10.7	100(1/1)	0
	河鲈鱼	2	37.2	18.8	55.5	100(2/2)	0
	鲟鱼	2	23.0	4.8	41.2	100(2/2)	0
	鲶鱼	2	28.8	1.5	56.0	50.0(1/2)	0
	总计	20	11.0	1.5	56.0	46.7(14/30)	0
环丙沙星	鲤鱼	8	1.5	1.5	1.5	0	—
	鲫鱼	6	1.5	1.5	1.5	0	—
	罗非鱼	6	1.5	1.5	1.5	0	—
	草鱼	3	1.5	1.5	1.5	0	—
	黑鱼	1	1.5	1.5	1.5	0	—
	河鲈鱼	2	1.5	1.5	1.5	0	—
	鲟鱼	2	5.3	1.5	9.1	50.0(1/2)	—
	鲶鱼	2	5.2	1.5	9.0	50.0(1/2)	—
	总计	20	2.0	1.5	9.1	6.7(2/30)	—

注：“—”表示无限量标准。

3.4.2不同种类淡水鱼喹诺酮检出情况

此次共检测淡水鱼种类有8类，8类淡水鱼均检出喹诺酮类兽残，其中鲤鱼和鲶鱼检出两种喹诺酮类兽残。结果见表6。

4讨论

4.1仪器条件的选择及优化

喹诺酮类化合物分子结构中含有羰基等多电子基团，易于在ESI源的正离子模式下形成准分子离子，根据仪器响应值和干扰情况，选正离子扫描模式。流动相的使用对多残留分析的影响很大，喹诺酮类兽残具有相似的母核结构，较难进行色谱行为分离，由此分别试验常用流动相水、弱酸水溶液、乙腈以及甲醇，从保留时间、分离效果、峰形等进行比较，运用乙腈和甲醇的洗脱能力不同，加入甲醇改善乙腈洗脱能力，使乙腈和甲醇有机结合起来，通过比较不同比例混合组成的乙腈和甲醇的洗脱效果，综合考虑，采用0.1 %甲酸水溶液-40% 甲醇-乙腈作为流动相的保留时间和分离效果较好。通过优化后得到最佳梯度洗脱程序见表1。

4.2前处理方法的选择及优化

4.2.1提取试剂的选择

分别对常见的提取剂乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷等按不同比例进行比较，结果发现：乙腈是提取鱼肉中喹诺酮类药物的效果较好，经分析对比后选用乙腈-水-冰乙酸（84∶15∶1，v/v/v）溶液作为提取剂。

4.2.2提取方式优化

常见提取方式有涡旋震荡提取、超声提取、索式提取、加速溶剂萃取、基质分散提取，经比较对比：索式提取回流时间在8-16h，有机溶剂消耗量，人力和经济成本较高。加速溶剂萃取要有专门提取仪器，采用涡旋震荡提取和超声提取效果最好，如两者结合用提取效率没有明显差异，为节约时间、简化操作选涡旋震荡提取。

4.2.3净化条件优化

鱼肉样品经酸化乙腈提取后，蛋白质和大部分干扰物已清除了，但仍有少量脂肪等杂质需要净化，采用QuEChERS 净化手段对样品进行处理。常用到的净化剂有 C18、GCB、PSA 等。试验他们净化效果，GCB吸附谱较广，去除色素效果明显，PSA去除极性基质，C18吸附非极性到中等极性化合物，除脂效果较好，并且对喹诺酮无显著吸附，回收率高，经比较其用量，选用250mgC18净化效果最好。

本法针对鱼肉基质特性和喹诺酮类兽药的理化性质，通过优化样品提取、净化方式和仪器条件，建立了淡水鱼中 6种喹诺酮类抗生素的超高效液相色谱串联质谱快速筛查方法。快速、简捷、灵敏度高、准确度好，成本较低，能够满足鱼肉样品以及其他水产品中喹诺酮兽药残留的快速检测和大量筛查。通过对检测数据进行分析，初步掌握了淡水鱼中兽药残留的残留水平，为相关监管部门提供了理论数据。

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淡水鱼中喹诺酮兽药残留的超高效 液相色谱串联质谱测定法

淡水鱼中喹诺酮兽药残留的超高效液相色谱串联质谱测定法