【我们不一YOUNG】高效液相样品前处理的注意事项和特殊样品的移液技巧

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2024/07/09

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前处理综合讨论

高效液相样品前处理的注意事项和特殊样品的移液技巧

样品预处理的目的是为了除去干扰物、增加检测器灵敏度(富集) 、保护色谱柱等，同时也是为了防止仪器罢工。其中样品萃取是胜败的关键一步,要从大量的干扰物中萃取出微量组分难度极大。样品预处理应包括进样前的一切操作。除了称重、溶解、稀释等步骤外，还需要走这几步:
①过滤;
②萃取;
③衍生化(柱前衍生) ;
④液相色谱(低压柱层析)。
可以是手工进行也可以实行自动化操作。

样品预处理的方法:
有些样品经预处理后还不能作进样分析,需进行衍生化处理，使一些无紫外吸收或无荧光的组分,经过衍生化后能用紫外和荧光检测器检测，这样既提高了灵敏度，又改善了分离度(质量变化) 。

用于液相色谱分析的样品溶液要求很高，必须均匀无颗粒,有颗粒会损坏进样器并阻塞柱头。处理好的样品在准备上柱前应对准光线摇动，检查样品溶液中有无颗粒。只要看到颗粒、混浊或乳化，就应过滤一下，过滤膜要能截留住0.15μm 以上的颗粒。

萃取的目的是从共溶的样品介质中分离出被分析的组分，或者减少损坏柱的物质(如蛋白质等)和干扰物。一般采用有机溶剂萃取，要求萃取用的溶剂毒性低、挥发性好、杂质少、对待测样品有良好的溶解度且与水又不相混溶。常用的有乙醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯或者两种以上的混合溶剂。萃取后一般可直接进样，有时需要浓缩或吹干浓缩,再用定体积的液体或流动相溶解进样，这样增加了样品浓度、提高了灵敏度，同时避免了溶剂峰对样品峰的干扰。在萃取时要考虑样品分子的溶解能力。除了脂溶性和水溶性组分外，还有用脂溶性的组分制成水溶性的盐。

1、水溶性样品
(1) 酸性组分及生成的盐萃取方法：有机溶剂萃取杂质后调成酸性,再加有机溶剂萃取或进样,或在N2 流下吹干,用适当的溶剂解后进样。
(2) 碱性组分及生成的盐萃取方法：有机溶剂萃取杂质后调成碱性,再加有机溶剂萃取或进样,或在N2 流下吹干,用适当的溶剂溶解后进样。
(3) 中性组分萃取方法：有机溶剂萃取杂质后,直接用反相色谱法分析。

2、脂溶性组分萃取方法:
有机溶剂萃取或进样，或在N2流下吹干，用适当的溶剂溶解后进样。

分析中可能出现的污染

一般检测的环境、容器、试剂都是影响测定结果的因素。
1、环境污染
仪器室的有害气体、气溶液、灰尘等等都能造成污染，影响检测结果,这种污染很难校正。因此,仪器室与其他实验室应隔离，保持清洁,仪器室内应安装空调,注意防潮、防腐、防震、空气相对湿度应小于70%为宜。
2、容器
实验室常用的器皿有玻璃类、瓷类、石英类、塑料类等，在进行分析时,应按照待则样品的要求来选则器皿,不管使用哪种器皿,容器的洗条清洁都是很重要的，也是取得好的检测结果的基本保证。
3、试剂
在液相色谱分析中,所选用的试剂必须是色谱纯、优级纯或分析纯,如果用含量有杂质的试剂,则会出现杂峰而影响测定结果。

对标准溶液的要求
在配置标准溶液时，先要配置现定浓度的内标溶液，在标准溶液和样品溶液中最好使用同一批次配制的内标溶液以减少误差。
(1) 配制标准溶液的物质应当是色谱纯的、性质稳定。
(2) 常用的标准溶液应存放在棕色溶液瓶中低温保存。
(3) 在配制维生素类标准品时,要放置在棕色容量瓶中或避光放置以免分解。

样品预处理过程中可能出现的问题
(1)色谱图中出现无关的峰,原因有可能是样品过滤器带来污染,解决方法如下:
①将过滤器浸泡在样品溶剂中并进样试验;
②改变过滤器类型;
③采用交替清洗技术。
(2) 一些或全部化合物的峰比预期的小,尤其是低浓度的样品,原因可能是样品过滤器表面吸附下降,解决方法如下:
①改变过滤器类型;
②严格按相同条件处理所用样品;
③采用交替清洗技术。
(3) 回收率太低或差,原因可能是萃取不完全,解决方法如下:
①增加萃取时间,使用热溶剂;
②修改清洗方法。
(4) 色谱峰变宽,柱寿命缩短,原因可能是样品带来的干扰与污染,应改进清洗方法。
(5) 精度差,原因可能是回收不完全,解决方法如下:
①改进或替换衍生化、分离、萃取或其他条件;
②用自动化处理装置提高精度。

特殊样品的移液技巧
多数情况下，移液器的移液对象是水溶液，但也难免会碰到一些特殊的样品，如高挥发性样品、高粘度样品、高密度样品等。如果需要经常转移这些特殊的样品，建议购买外置活塞原理的移液器，虽然耗材成本有点高，但移液精度有保障；如果只是偶尔转移特殊样品，且财力有限，那么请您看看以下移液技巧，或许能帮助您提高移液精度。

移取挥发性样品
在移液前务必对移液器润洗两遍；吸液完成后要尽快排液。

移取高粘度样品
采用反向移液模式：
在吸液时把吸/排液按钮按到第二档（第二停止点），而在排液时把按钮按到第一档（第一停止点）。另外，在吸液和排液时均需要3～5秒的停留时间。

移取高密度／低密度样品
移液器的精度数值都是基于转移纯水，如果样品的密度与水的密度相差很大，那么精度也会相应地差很多。因此在移液前需要先弄清楚样品的密度，然后把量程调节成待转移样品体积与密度的乘积。例如一个样品的密度是1.2g／cm3，需要转移300μL，应把量程设置为360μL。这只是粗略的调整方法，严格的调整方法还需要借助量器或天平作为辅助工具进行准确的计算。

移取高温／低温样品
移液前一定不要润洗吸头；每次移液都要换一个新吸头；吸液和排液都要尽快完成。

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