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【我们不一YOUNG】+水源性致病微生物检测水样前处理方法之离心法

memory光阴

2024/07/18

前处理综合讨论

基于离心的前处理方法是利用离心力将大小、形状、密度和介质黏度不同的颗粒从液体介质中分离出来,是分子生物学实验室中最常用的技术之一,主要包括直接离心法和密度梯度离心法。

1．直接离心法

直接离心法是直接对水中的微生物进行离心,通过将大部分微生物沉降于管底来达到分离及富集浓缩的目的。根据目标微生物的大小不同可选择不同的离心条件。原虫体积较大,直径>3 μm,选用的离心力一般为500～2 000 g;细菌直径一般为0.5～10 μm,常用的离心力为3 000～12 000 g;病毒直径一般为0.01～0.1 μm,常用的离心力为90 800～171 000 g。Maal等以8 000 g离心10 min后提取DNA的方法对伊朗伊斯法罕南部污水处理厂的进水水样进行大肠埃希氏菌菌株的分离鉴定。《生活饮用水标准检验方法第12部分: 微生物指标》(GB/T5750.12—2023)采用Filta-MaxXpress快速方法对饮用水中贾第鞭毛虫/隐孢子虫进行测定时,采用的分离条件是2 000 g离心15 min。Ahmed等对澳大利亚布里斯班某城市污水处理厂的进水水样进行小鼠肝炎病毒测定时采用的分离条件是以100 000 g在4 ℃下离心1 h,之后提取RNA并结合实时qPCR(RT-qPCR)完成检测,回收率为33.5%±12.1%。

直接离心法的优点主要体现在以下几个方面:①方法成本只涉及离心机的初始投资, 使用中不需要化学试剂或其他昂贵的消耗品;②速度快, 可以在相对较短的时间内完成大体积水样的处理;③方法操作简单、技术要求低, 操作过程中不会引入其他物质、试剂, 对目标微生物影响较小。然而, 直接离心法也存在不足之处:①在富集目标微生物的同时会对其他颗粒进行富集, 特别是对于浑浊度高的水样, 容易对后续操作(如核酸提取、PCR检测等) 造成影响;②离心后倾倒上清液时易造成目标微生物损失。

2. 密度梯度离心法

密度梯度离心法是用一定的惰性介质(蔗糖、甘油等)在离心管内形成连续或不连续的密度梯度,根据微生物在密度梯度液中的比重不同,通过离心力的作用使目标微生物分离的一种技术。Garrison等在弗吉尼亚州诺福克的拉斐特河和海湾流淌的水中加入大肠埃希氏菌和鞭毛虫后, 采用蔗糖密度梯度离心法实现了对两种微生物的富集。Chesnot等采用不同惰性介质的密度梯度离心法实现了浑浊水样中隐孢子虫卵囊的富集, 已发布的GB/T 5750.12—2023中两虫检测也新增了密度梯度法。Hinzke等使用蔗糖密度梯度离心法根据微生物大小从海水中富集了细菌共生体。

密度梯度离心法的优点是:①分离效果好, 可一次获得杂质较少的目标微生物;②适用范围广, 既能分离沉降系数不同的颗粒, 又能分离密度不同的颗粒。该法存在的局限性是:①成本昂贵;②需要制备惰性介质溶液;③操作复杂, 不易掌握。

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