固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定食品中丙烯酰胺
1立题背景与目的意义
丙烯酰胺（Acrylamide，AA,CAS:79-06-1）是一种白色晶体（化学）物质，水溶性化学物质，最开始作为一种工业原料为人们所熟知[1]，用于生产聚丙烯酰胺以及常见的除臭剂、洗涤剂等[2]。经过热加工（如煎、炙烤、焙烤）的土豆、谷物产品中会产生丙烯酰胺，主要途径为高碳水化合物、低蛋白质食物中天冬酰胺和还原糖在高温条件下通过美拉德（Mailllarder）反应生成[3-5]。职业暴露研究及体内动物实验均表明AA可能通过促进细胞凋亡实现对神经系统的损伤[6-9]，国际癌症研究中心已经确认丙烯酰胺为（动物的）可能致癌物，对人体具有神经-生殖-内分泌毒性[10-11]。2002 年瑞典研究人员首先从高温处理后的油炸薯片、薯条等富含碳水化合物的食物中检测出高浓度的丙烯酰胺，国家食品安全风险评估中心2012年发布《食品中丙烯酰胺的危险性评估报告》，对其毒性、形成、人体可能暴露量等进行分析评估。2015年欧洲食品安全局（EFSA）也通过分析结果发现薯片中丙烯酰胺很高，为522μg/kg，我国的调查数据也显示薯片含量最高，为898μg/kg,油条、油饼、焦圈、薄脆等油炸食品含量也较高[12-14]。中国香港、美国、欧盟及CAC（食品法典委员会）均发布了减少丙烯酰胺含量的业界指引。2018年4月生效的欧盟法规2017/2158规定了为减少食品中存在的丙烯酰胺所需的缓解措施和基准浓度。新法规将要求食品经营者在其食品安全管理体系中采用简单、实用的步骤来管控丙烯酰胺。以确保食品的安全性，我国因对丙烯酰胺关注研究晚于欧盟等国家，各类食品中丙烯酰胺检测数据较少，目前尚未发布食品中丙烯酰胺限量标准，因而对各类食品进行丙烯酰胺检测与数据收集评估尤为重要。对于丙烯酰胺这类通过食品生产和加工过程中形成的有毒有害物质，对人类健康构成潜在的危害，也是影响食品安全的重要因素。华西教材）由于人群广泛接触， 其健康风险受到人们的广泛关注。
目前，国标法GB 5009.204—2014第一法用稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法，13C3内标，以水为提取溶剂经过HLB固相萃取柱和Bond Elut-Accucat固相萃取柱或基质固相分散萃取（玻璃层析柱，临用前装填）净化，第二法用稳定性同位素稀释的气相色谱-质谱法，以水提取，采用基质固相分散萃取净化、溴试剂衍生。国标方法[15]、文献报道方法[16-18]大多需要淋洗、洗脱、浓缩，过程较为复杂、繁琐，影响重复性。本方法在LC-MS/MS的基础上结合国家食品安全风险检测手册，对前处理进行了优化，尤其针对（匹配）高含油量的基质情况，简化了提取步骤，增加了操作的便利性，选用HSS T3色谱柱，优化色谱和质谱条件，增强了AA的保留，使AA与共流出物分离更理想，优选了更切合工作实际的目标离子对，使定性更为准确，顺利建立了一种适用于食品中丙烯酰胺大批量检测方法，获得了较高的灵敏度和更低的检出限。
鉴于食品中丙烯酰胺对人体健康的影响，通过对河南省9个地市油条、方便面、烘焙类、膨化类等热加工食品中丙烯酰胺含量进行检测分析，了解河南省食品中丙烯酰胺的污染状况、污染水平、污染食品种类和程度，发现食品安全隐患，防止食品中丙烯酰胺污染对人体健康的危害，为食品安全风险评估、标准制定、修订及跟踪评价提供相关数据基础。监测结果及其分析结论，可以成为当地政府开展食品安全风险管理工作重要的技术信息来源以及方向指引。
2材料与方法
2.1材料
2.1.1样品来源
在河南省9个地市共采集315份，样品种类包括油条、方便面、烘培食品及膨化食品。包含烘焙类、油条、膨化、方便面等四类样品，采集地点覆盖超市、农贸市场、路边摊点。
2.2.2仪器与试剂
超高效液相色谱-串 联 质 谱 仪 ( TQ-S美 国Waters) ；高速粉碎机；多位试管涡旋振荡器（德国Heidolph Multi Reax）；氮吹仪（美国 organomation，N-EVAP-112）；P-SCX固相萃取柱（Welchrom 60mg/3ml）；丙烯酰胺标准溶液（批号：A2002036，100.0 μg/mL，坛墨质检标准物质中心）、丙烯酰胺-13C3内标溶液（TMstandard 1000.0 μg/mL），丙烯酰胺标准物质P99274（广州谱恩科学仪器有限公司,106±25μg/kg）；乙腈( CH3CN，色谱纯），滤膜（0.22 μm，美国 Millipore)。
2.2 方法
2.2.1 标准溶液的制备
准确吸取一定体积的丙烯酰胺标准溶液于10mL容量瓶中，水定容，得相应浓度标准使用液（1.0μg/mL）。再准确吸取一定体积的丙烯酰胺-13C3内标溶液于5mL容量瓶中，水定容，得相应浓度内标使用液（4μg/mL）。临用前进一步稀释成一系列标准溶液，水定容混匀，得到标准曲线系列溶液。临用前准确移取适量丙烯酰胺标准使用液和同位素内标使用液，进一步稀释成浓度为5、10、20、50 、100、200、500ng混合标准系列溶液，水定容。标准系列溶液中丙烯酰胺浓度分别为，含丙烯酰胺-13C3浓度为100 ng。
2.2.2 样品处理
准确称取充分搅碎样品 2 g（精确至 0.01 g），于 50 mL 离心管中，加入丙烯酰胺-13C3使用液（4μg/mL）100μL，静置后加入9 mL水后并振摇使试样分散，再加入10 mL乙腈，7mL正己烷，涡旋1min。加入1.5 g 无水醋酸钠和6 g无水硫酸镁，涡旋振荡1h，4℃以下低温 10000 r/min 离心 10 min，弃去上层正己烷层，取乙腈层 3mL 过 SCX 固相萃取柱，直接收集上柱的乙腈溶液，在氮气下吹干，用 0.3 mL 水溶解残渣，过尼龙滤膜后测定。
2.2.3 仪器条件
色谱:流动相：流动相：A：0.1%甲酸水溶液；B：甲醇；色谱柱：Acquity UPLC®HSS T3柱（2.1×100 mm，1.8 μm）；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；样品室温度：15 ℃；进样量：10μL。梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
ESI+ |
时间（min） | A（%） | B（%） |
0.0 | 90 | 10 |
4.5 | 10 | 90 |
6.0 | 5 | 95 |
6.5 | 90 | 10 |
8.5 | 90 | 10 |
6.0 | 90 | 10 |
质谱: 电喷雾离子源( ESI+) ，离子源温度为 150 ℃ ， 毛细管电压 3.0kV ，脱溶剂气温度为 500 ℃ ，脱溶剂气流速为 800 L / h， 锥孔反吹气流量：150L/ h，多反应监测模式(MRM)。其他质谱条件见表2。
2.3工作曲线的绘制
在3.2.3测定条件下，依次对标准空白，标准系列，样品空白及样品进行测定，以系列中丙烯酰胺含量（ng）为横坐标，以丙烯酰胺及其内标物的定量离子峰面积比值为纵坐标，得到内标法标准曲线及回归方程，根据样品响应计算AA含量。
3 结果
3.1 质谱条件的选择及优化
采用100 ng/mL的丙烯酰胺标准溶液及其内标溶液，依据在正离子模式响应值和干扰情况，经过智能优化程序确定各毒素的母离子和子离子参数，丙烯酰胺和内标的离子质谱参数见表2；通过对色谱柱以及质谱参数的优化，获得理想的最低检出限。图1是丙烯酰胺标准溶液及其内标溶液（MRM）色谱图。
图1 丙烯酰胺标准溶液及其内标溶液（MRM）色谱图
表2丙烯酰胺和内标的质谱条件
化合物名称
| 母离子 | 子离子 | 碰撞能量 | 锥孔电压 | 保留时间 |
（m/z） | （m/z） | （V） | （V） | （min） |
丙烯酰胺 | 72.1 | 54.9*/27.15 | 8/12 | 22 | 1.66 |
丙烯酰胺-13C3 | 75.1 | 57.9 | 8 | 26 | 1.66 |
注：*为定量离子
3.2线性范围、检出限和定量限
丙烯酰胺在2～500 ng/mL浓度范围内线性关系良好，r 为0.9995；分别选取油条、方便面、烘培食品及膨化食品等4种不同基质空白样品加入适量丙烯酰胺标准溶液，用与样品相同的分析方法，以信噪比(S/N)为3计算方法检出限为2μg/kg，以信噪比(S/N)为10计算方法定量限为6μg/kg。
3.3回收率与精密度
分别选取油条、方便面、烘培食品及膨化食品等4种不同基质空白样品，加入不同浓度水平的丙烯酰胺标准使用溶液（1.0 μg/mL)，配制成低中高三个浓度水平的加标样品，用与样品相同的分析方法进行6次平行试验，加标浓度、回收率以及相对标准偏差(RSD)见表3，加标回收率在91.9%～112.6%之间，RSD为2.3%～4.9%。
表3 丙烯酰胺在4种不同食品基质中的回收率和精密度（n=6）
化合物
| 加标水平 （μg/kg）
| 油条 | 方便面 | 烘培食品 | 膨化食品 |
回收率 （%） | RSD （%） | 回收率 （%） | RSD （%） | 回收率 （%） | RSD （%） | 回收率 （%） | RSD （%） |
| 20 | 91.9 | 2.3 | 92.7 | 4.8 | 100.9 | 4.8 | 98.3 | 4.8 |
丙烯酰胺 | 50 | 93.2 | 3.8 | 103.1 | 4.6 | 113.3 | 3.3 | 106.3 | 3.2 |
| 100 | 93.7 | 4.0 | 93.5 | 3.9 | 109.5 | 4.7 | 112.6 | 4.9 |
注：*为定量离子
3.4质控样品验证
为验证方法的适用性及准确度，对丙烯酰胺标准物质P99274[（106±25）μg/kg]进行测定，分别称取 0.5g(精确至 0.0001 g)质控样品各 2 份，用与样品相同的分析方法进行测定, 测定结果为105.2μg/kg，结果在标准物质含量范围内，结果准确可靠。
4讨论
4.1 前处理方法的选择及优化
对油条、方便面、烘培食品及膨化食品 4类不同基质样品，加入不同体积(3mL、5mL、7mL、9mL、11mL)正己烷除油脂，发现正己烷加入量小于5mL，基质效应大，存在堵柱的现象，加入至少7mL正己烷后分层效果明显，尤其对于油条等含油量较高样品，基质效应已得到明显改善，综合考虑，采用7mL正己烷除油脂，除脂后直接过柱除杂，无需活化、淋洗、洗脱，操作简单，P-SCX的苯磺酸基团，对提取液中强碱性阳离子状态的杂质保留，对丙烯酰胺不保留，达到除杂目的。
4.2 基质效应的评价
通过对油条、方便面、烘培食品及膨化食品等4种基质进行分析，以待测物在空白基质液中的响应和在纯溶剂中响应的比值来评估基质效应，丙烯酰胺在4 种基质样品中的基质效应范围为 12.8% ～ 83.7%，表示在这4种常见的基质中存在一定的基质效应（增强或抑制）。目前一般采用样品稀释、内标校正、基质匹配校正等方法来降低基质效应[18]，本实验采用加入同位素内标进行定量，以确保结果的准确可靠。
4.3同位素内标的应用
内标法是通过测定内标物和待测组分响应的相对值来进行计算的，一定程度上能消除提取效率、过柱损失、基质效应等方面的误差，该方法提取后样品溶液分为三层，乙腈层为中间层，采用同位素内标定量，在吸取3 mL乙腈层过柱时，为方便操作可粗略吸取约3 mL，避免吸入水层和正己烷溶液，影响过柱和氮吹，体积不同不影响最终结果，同时该法在标准系列中和样品中的加入（4μg/mL）20μL内标，内标含量均为100ng，标准系列浓度点和内标加入量均采用绝对质量ng为单位，区别于常规的内标上机以浓度为单位的设计方法，定容体积不参与计算，可以根据氮吹后复溶样品溶液的浑浊程度适当改变定容体积（0.5~1.0 mL之间），方便实际操作结果计算简单。
4.4 色谱柱选择
丙烯酰胺极性较强，在普通C18色谱柱保留不强，出峰时间较早，1.06分出峰，不利于与样品中极性物质的分离，HSS T3柱采用低配基密度C18和三点键合技术，能够耐受100%水相，增强了水溶性的、极性大的小分子有机化合物的保留，有利于与共流出物的分离，峰型和响应也得到改善。
5结论
本法前处理快速、简捷、灵敏度高、准确度好，结合同位素内标的应用，校正了基质效应，经正己烷除脂，不需淋洗、洗脱，过P-SCX柱直接收集，有较好的除杂净化效果，HSS T3柱的使用，使线性范围更宽，优选的目标物离子对，更为适合高油类基质情况，可满足常规实验室快速大批量测定食品中丙烯酰胺污染情况的需求。本研究对河南省北部9地市检测食品按油条、方便面、烘焙类、膨化类进行分类采样，检测各类食品总计315份，结果显示，四大类食品总体检出率达89.5%(282/315），最高含量8530.6 μg/kg，其中，油条和膨化食品全部检出，方便面检出率次之，为97.8%，烘焙食品检出率为64.4%。通过对检测数据进行分析，迅速提供了食品中丙烯酰胺监测工作便捷精准的测定方案和污染水平的相关信息。
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