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液相色谱常见问题解析之色谱柱寿命短
p3203140
2024/09/06
私聊
液相色谱(LC)
“
在HPLC日常分析工作中,有几个常见的问题一直困扰着我:色谱柱寿命太短;峰拖尾;保留时间重现性差;分不开;保留弱等。
”
遇到以上问题该怎么去排查与优化呢?
我们今天看一下色谱柱寿命短的问题。
我们分析原因无非是:样品脏、没有色谱柱保护措施、色谱条件比较极端。
01
—
样品前处理
我们要了解样品的来源,比如天然产物提取物、生物样品、发酵产物、合成产物等。
如果是天然产物提取物,我们要做的前处理工作是根据目标物的性质,富集目标物,并除去色素等污染色谱柱的成分;
如果是生物样品,来源可能是生物组织、血液等,需要去除磷脂、蛋白等污染色谱柱的成分,并富集低含量的目标组分;如果是发酵产物,需要去除发酵液中的糖等营养物质、微生物细胞的破碎后的组分等,并富集低浓度的目标组分;如果是合成产物,我们要了解反应液的残留成分、副产物、以及过量的原料等,对色谱柱产生污染的成分进行适当的去除。
02
—
柱前保护
色谱柱的污染来源,一个是来自样品,另一个是来自流动相。我们在色谱柱前面加一些保护措施,以防止来自样品和流动相的污染。在进样器前端可以加上在线过滤器,防止流动相中的污染物进入色谱柱;在色谱柱前端加上保护柱,以防止样品中的强保留物等污染物进入色谱柱,还可以对流动相的污染物进行二次防护。
03
—
色谱条件优化
色谱柱寿命短的另外一个因素,就是色谱条件比较极端。流动相缓冲盐浓度过高;流动相pH太极端;柱温过高;柱压过高。
流动相缓冲盐浓度太高,那么缓冲盐中的机械杂质也可能更多,我们要将缓冲盐进行过膜抽滤处理;缓冲盐浓度太高时,如果梯度后面有机相比例太高时会产生盐析,堵塞混合器、进样器、色谱柱以及管路等,所以有机相比例不能太高,或者强洗脱相中加20%水。
一般硅胶基质色谱柱的pH耐受范围在2-6,如果pH低于2,硅胶的键合相易水解脱落,如果pH高于7,硅胶填料容易溶解流失。如果需用到极端的pH,那么建议使用耐宽pH的色谱柱。
一般厂家建议色谱柱耐受50℃以下柱温,过高的柱温可能会引起色谱柱寿命变短。
我们有的色谱条件会使柱压比较高,比如流动相的粘度太大(可以适当升高柱温或者更换粘度低的流动相);小粒径色谱柱柱压会更高(可以使用高柱效的核壳类色谱柱,大粒径的核壳色谱柱柱效也不会降低较多)。
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