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【金秋计划】重组工程菌发酵表达

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2024/09/06

食品常规理化分析

一、准备阶段（大肠杆菌为例）

根据试验需求，准备合适的培养基，比如说LB，参照相关内容。

准备移液枪枪头，接种环，玻璃棒等。

二、种子培养阶段
1.菌种活化：方法参照相关内容。
2.种子液接种：从保存的平板上挑取单克隆至种子培养液中（50mL/250mL），将其放置于恒温（37℃）摇床中振荡（200rpm）培养，过夜（约12h）。

三、摇瓶发酵培养阶段

1.摇瓶接种：将上述种子培养液按照一定比例（一般1%-10%）接种至新鲜的发酵培养基中（100mL/500mL）。

按照需要选择合适的三角瓶，比如说50mL/250mL、100mL/500mL，如果需要量比较小，也可以选择5mL/50mL，10mL/50mL等。

2.发酵培养：将接种后的三角瓶放置于恒温（37℃）摇床中振荡（200rpm）培养。

定期检测发酵生物量

摇起来有助于氧气的供应、微生物和营养物质均匀分布，使微生物更好地生长。

3.诱导阶段：约摇瓶培养2h左右，OD600达到0.6-0.8，此时添加诱导剂（IPTG）开始诱导，诱导目的基因表达，约5h。

一般诱导剂的浓度0.1mM-1mM，浓度过低过高都会影响表达效果。如果不知道多少合适，可以先选择0.5mM进行试验，后续再进行浓度筛选。

4.发酵结束：发酵结束，离心后去上清，收集菌体。

不同的微生物，表达产物的位置不同，收集相应的菌体或上清。

5.细胞破碎：取一定量菌体，用PPS重悬后，使用超声破碎仪破碎。

注意破碎功率和时间，注意冰水混合液降温。（糗事：第一次破碎忘记加冰。）

6.检测：定性检测，定量检测蛋白浓度，还有Western Blotting、酶活检测等。

酶活测定可以采用液相、气相，也可以采用比色法等方法。

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