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【金秋计划】雷公藤红素靶向COMMD3/8复合物抑制自身免疫病

城头变幻大王骑

2024/09/10

中药/天然药检测

雷公藤（Tripterygium wilfordii）在我国多地均有分布，具有悠久的药用历史，广泛用于治疗类风湿关节炎，在《本草纲目》等有记载。雷公藤红素（Celastrol）是从雷公藤植物中提取的一种生物活性分子，对于治疗自身免疫疾病和肿瘤等有显著作用，已被证明具有抗炎特性，然而，其作用机制尚未完全阐明。

1、COMMD3/8 复合物缺乏会损害体液免疫

COMMD3和COMMD8是COMMD蛋白家族成员，在诱导体液免疫反应过程中形成了介导B细胞迁移所必需的异二聚体，在调节免疫反应方面起着重要作用。作者构建了Commd3基因敲除小鼠（在没有另一个蛋白的情况下，COMMD3或COMMD8蛋白会被蛋白酶体降解），发现COMMD3缺失导致生发中心（germinal center，GC）的B细胞数量降低。为了分析COMMD3缺乏对免疫细胞的整体影响，作者通过质谱流式（CyTOF）和scRNA-seq均发现Commd3缺失降低GC B 细胞的比例。这些发现表明B细胞受到COMMD3/8复合物缺乏的选择性影响。

2、COMMD3/8 复合物缺乏可缓解关节炎

鉴于COMMD3/8复合物在体液免疫反应中的重要作用以及B细胞靶向疗法在类风湿关节炎（RA，Rheumatoid Arthritis）中的已知疗效，作者利用胶原诱导性关节炎（CIA，一种RA小鼠模型）来测试COMMD3/8复合物在自身免疫性疾病中的作用。结果显示COMMD3/8复合物缺失还改善了CIA，且在B细胞中表达的COMMD3/8复合物在CIA发病机制中起着重要作用。结果表明针对COMMD3/8复合物可能是治疗自身免疫性疾病的有前途的策略

3、雷公藤红素靶向抑制COMMD3与COMMD8结合

接着，为了寻找COMMD3与COMMD8结合的有效抑制剂，研究人员通过天然产物化合物库（2555种化合物）开展筛选，鉴定出雷公藤红素（Celastrol）是一种破坏COMMD3/8复合物的最有效的化合物，并通过生物发光共振能量转移（BRET）分析和CO-IP验证了雷公藤红素抑制COMMD3和COMMD8结合。此外，雷公藤红素处理加速了COMMD3和COMMD8的降解

4、雷公藤红素与 COMMD3 上的 C170 共价结合

雷公藤红素在C6处有一个亲电位点，半胱氨酸残基的亲核硫醇基团已证实可在此发生反应形成共价键。为了测试 C6 原子是否参与了雷公藤红素与 COMMD3/8 复合物的相互作用，作者获得了二氢雷公藤红素（雷公藤红素衍生物），其中C6位被还原并且失去了进行亲核加成的能力，发现二氢雷公藤红素不会破坏活细胞或纯化形式的COMMD3/8 复合物，表明雷公藤红素可能与COMMD3或COMMD8上的半胱氨酸残基形成共价键，从而解离COMMD3/8 复合物。

在COMMD3和COMMD8上的半胱氨酸残基中，COMMD3上的C170是位于COMM结构域内的唯一半胱氨酸残基，两个COMMD蛋白通过该结构域相关联。作者，将COMMD3上170位的C突变为A，发现含有 COMMD3 C170A的COMMD3/8复合物不再被活细胞中的雷公藤红素解离，表明COMMD3上的C170可能作为雷公藤红素的结合位点。进一步分子对接发现与C170结合的雷公藤红素很可能被埋在COMMD3和COMMD8的COMM 结构域之间的界面形成的疏水腔中，用雷公藤红素处理的纯化 COMMD3/8 复合物的质谱鉴定发现C170是该结构域内雷公藤红素的唯一共价结合位点。总之，这些发现表明雷公藤红素可能通过与 COMMD3 上的C170共价结合来解离 COMMD3/8 复合物

5、雷公藤红素重现 COMMD3/8 复合物缺乏症

接下来，作者想知道雷公藤红素是否能重现COMMD3/8复合物缺乏所导致的功能性后果。结果显示，雷公藤红素抑制小鼠 B 细胞对CXCR4和EBI2刺激的趋化性迁移，这与COMMD3/8 复合物作为趋化因子受体信号传导的正调节剂的作用一致。此外，与COMMD3/8复合物缺乏的情况一样，雷公藤红素可阻止B细胞中GRK6介导的配体激活的CXCR4磷酸化。质谱流式（CyTOF）显示使用雷公藤红素治疗可选择性降低GC B细胞的比例，同时保持其增殖能力，这与在他莫昔芬诱导的Commd3缺失的小鼠中观察到的情况一样

先前的研究表明，雷公藤红素治疗可抑制CIA的发展。作者证实在CIA发作时开始使用雷公藤红素治疗可阻止疾病进展。并重现COMMD3/8复合物缺乏对CIA中体液免疫反应的影响，降低血清中 TIIC 特异性抗体的滴度以及GC B细胞数量，而不会影响引流淋巴结中T H17和Treg细胞丰度，这些发现进一步表明雷公藤红素具有B细胞选择性作用。总体而言，雷公藤红素治疗表型模拟了COMMD3/8复合物的缺陷

6、COMMD3的C170A突变消除了雷公藤红素的活性

接着，作者发现COMMD3的C170A突变使COMMD3/8复合物对雷公藤红素具有抗性。为了验证COMMD3/8复合物是雷公藤红素的真正靶标，作者生成了表达来自内源性Commd3基因座的COMMD3 C170A的小鼠，并测试雷公藤红素在这些小鼠中的作用是否被消除。结果显示，从COMMD3 C170A/C170A小鼠中分离的B细胞在CXCR4和EBI2介导的趋化反应以及GRK6介导的CXCR4磷酸化中表现出对雷公藤红素的完全抗性。此外，雷公藤红素治疗不会抑制突变小鼠的体液免疫反应。质谱流式（CyTOF）和scRNA-seq分析均表明，在免疫的突变小鼠中，雷公藤红素治疗不会显著影响任何可检测到的免疫细胞群。此外，COMMD3 C170A/C170A小鼠的CIA进展和TIIC诱导的体液免疫反应并未受到雷公藤红素治疗的抑制，这进一步证实了这些小鼠对雷公藤红素的无反应性。这些发现表明COMMD3/8复合物是雷公藤红素的主要分子靶点

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