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【金秋计划】雷公藤红素靶向YY1和HMCES蛋白诱导白血病中DNA损伤和细胞死亡
城头变幻大王骑
2024/09/10
私聊
中药/天然药检测
1、雷公藤红素抑制CML细胞增殖作者首先进行了网络药理学分析,以评估在治疗CML方面最有效的天然产物。通过对3882种天然产物进行了网络药理学分析,发现从传统中药“雷公藤”(Tripterygium wilfordii)根皮中提取的五环三萜雷公藤红素在抑制CML方面排名第一。为了验证网络药理学筛选的可靠性,作者在CML细胞中进行细胞活力测定。选择18β-甘草次酸作为阴参,因为它与雷公藤红素的结构最相似,但在3882 种天然产物中预测得分不高,选择17-AAG(HSP90抑制剂,已有文章报道HSP90是雷公藤红素的靶点)和TKI 药物伊马替尼作为阳参。结果表明雷公藤红素、17-AAG和伊马替尼均能有效抑制CML细胞增殖,而18β-甘草次酸几乎不影响细胞生长。作者进一步开展细胞实验,发现雷公藤红素对K562和K562T315I细胞表现出抗增殖活性,诱导细胞凋亡。尽管对雷公藤红素的研究很深入,但尚未系统地鉴定出雷公藤红素在CML中的直接蛋白质靶点,尤其是在耐药性CML细胞中
雷公藤红素抑制CML细胞增殖2、雷公藤红素处理后 K562T315I 细胞的转录组和蛋白质组学分析接着,作者通过RNA 测序发现富集的通路包括铁死亡、蛋白水解调节、响应p53介导的DNA损伤等。作者还进行了蛋白质组学分析雷公藤红素对K562T315I细胞中蛋白质表达水平的调节,下调蛋白主要富集于DNA和RNA代谢途径以及 DNA损伤反应,以及蛋白质加工途径。MCODE分析发现“对DNA损伤刺激的反应”和“对未折叠蛋白的反应”分别是最具特征性的途径。雷公藤红素与其已知靶标HSP90的相互作用可能是“对未折叠蛋白的反应”上调的关键贡献事件。而目前尚未有报道称雷公藤红素的直接蛋白质靶标与“对DNA损伤刺激的反应”途径有关(
雷公藤红素处理后 K562T315I 细胞的定量蛋白质组学分析3、雷公藤红素处理后 K562T315I 细胞的CETSA-MS分析作者接着检测了K562T315I细胞中celastrol处理后可溶性蛋白质水平的变化,在雷公藤红素处理后鉴定了178种差异溶解蛋白质,主要位于DNA中心区域,包括细胞核和线粒体,更具体地说是在DNA损伤位点。此外,“分子伴侣复合物”中溶解度降低,这可能是由于雷公藤红素和HSP90之间的互作所致
雷公藤红素处理后 K562T315I细胞的CETSA-MS分析4、雷公藤红素诱导 K562T315I 细胞DNA损伤对 K562T315I细胞经雷公藤红素处理后总蛋白和可溶性蛋白水平变化的系统分析表明,雷公藤红素主要诱导K562T315I细胞中的DNA损伤和未折叠蛋白反应。因此,作者进行了实验来验证这些观察结果。结果显示雷公藤红素显著诱导γ-H2AX(DNA损伤的常见标志物)的表达,并降低DNA损伤修复相关蛋白FANCD2水平,彗星试验进一步证实了雷公藤红素促进的DNA损伤(
雷公藤红素诱导 K562T315I细胞DNA损伤5、雷公藤红素在K562T315I细胞中的靶点鉴定然后,作者在细胞裂解物中开展质谱耦合等温剂量反应-细胞热位移分析(MS-ITDR-CETSA)实验,以确定雷公藤红素的直接蛋白质靶标,特别是那些参与DNA损伤反应的蛋白质靶标。在检测到的3393种蛋白质中,有12种蛋白质表现出热稳定性的显著变化,代表了最有潜力且可信度高的靶标蛋白质。值得注意的是,雷公藤红素的已知靶标HSP90 (HSP90AA1和HSP90AB1) 的热稳定性仅表现出很小的变化,并且没有超过阈值。对这12个潜在靶标和定量蛋白质组学以及CETSA-MS分析的差异蛋白进行PPI分析,发现 YY1均为最紧密相关的蛋白质。因此,YY1与所有这些DEP/DSP的关联节点数量最多,并且可能是与DNA损伤相关的最重要的靶标。现有研究表明,YY1作为转录因子,可以调节参与DNA修复和细胞存活的各种蛋白质的表达,以响应DNA损伤。此外,HMCES已被确定为通过屏蔽脱碱基位点来保护基因组完整性免受氧化碱基损伤的关键蛋白。因此,作者继续通过蛋白质印迹结合细胞热位移分析(WB-CETSA)验证了celastrol与YY1和HMCES的互作。同样,报道的阳性对照HSP90蛋白也显示出明显的热稳定性增加(
雷公藤红素在K562T315I细胞中的靶点鉴定6、雷公藤红素与YY1和HMCES相互作用的验证为了进一步验证celastrol与YY1和HMCES的直接相互作用,合成了可点击炔烃标签功能化celastrol探针(Cel-P),该探针保留了celastrol对K562T315I细胞的抑制活性。利用该探针开展Pulldown实验发现Cel-P 能够成功地从细胞中拉下HMCES和HSP90蛋白,但由于尚不清楚的原因,在蛋白质印迹膜上的下拉样本中未检测到YY1。随后,表达并纯化重组YY1(rYY1)蛋白,发现随着Cel-P浓度的增加,rYY1的标记以剂量依赖性方式增加
雷公藤红素与YY1和HMCES相互作用的验证7、雷公藤红素通过靶向YY1和HMCES诱导DNA损伤在验证了celastrol与YY1和HMCES之间的相互作用后,作者继续在K562T315I细胞中敲低 YY1或HMCES。结果显示YY1或HMCES的敲低显著增加了DNA损伤的发生率,同时影响细胞生长,增强细胞对celastrol的敏感性。此外,与HMCES相比,YY1敲低对细胞的影响更为显著,表明YY1发挥着更为重要的作用。对接分析显示,与HMCES相比,celastrol对YY1的亲和力略强,且Celastrol与YY1上的Leu132和Val316形成氢键,与HMCES的Glu127、Arg130和Arg137形成氢键
雷公藤红素通过靶向 YY1 和 HMCES 诱导 DNA 损伤鉴于YY1在雷公藤红素诱导的DNA损伤反应中发挥关键作用,作者对YY1蛋白进行了进一步实验。发现YY1过表达对细胞生长没有显著影响,但减轻了雷公藤红素引起的细胞死亡和DNA损伤,且通过裂解的PARP1和Caspase-3水平发现YY1表达与雷公藤红素诱导的细胞凋亡呈负相关。使用双荧光素酶报告基因发现雷公藤红素显著抑制了YY1的转录活性,BLI结合试验发现celastrol 可以与 rYY1 结合(图8)。图8 YY1在雷公藤红素诱导的 K562T315I细胞DNA损伤和细胞死亡中起关键作用总结研究使用多组学方法对雷公藤红素的作用机理进行了系统研究,利用蛋白质组范围的无标记靶标反卷积方法MS-CETSA来识别雷公藤红素的蛋白质靶标。研究不仅验证了雷公藤红素通过靶向HSP90来诱导未折叠蛋白反应,而且还发现它通过直接靶向耐药 K562T315ICML 细胞中的YY1和HMCES来诱导DNA损伤(图9)。研究有助于更好地理解雷公藤红素的多方面机制。研究提供了一种有效的系统药理学工作流程范例,该范例集成了网络药理学分析、蛋白质丰度和溶解度测量以及 MS-CETSA,以揭示任何天然产物或活性化合物的作用机理。
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