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液相液质方法开发流程及经验总结

zhangyongmei

2024/09/11

液质联用（LCMS）

液相液质方法开发流程及经验总结

给你一个未知的化合物，我们如何快速的建立定量方法，以及我们在建立方法过程中需要注意的问题，下面主要是我实验过程中总结的几点，供大家参考。

一、确定分析目标

1.1 明确目标化合物CAS号、结构、分子式、极性、沸点、溶解度、稳定性、检测限度等相关信息。

1.2 固体样品明确样品的溶解度。如果已经为液体样品则可以省略该步骤。

1.3 查找目标化合物及样品的相关文献；

1.3.1 查找到相关文献；参照文献里面的溶剂、色谱柱、仪器、流动相等建立定量方法。

1.3.2 未查找到相关文献；通过化合物的极性选择色谱柱、流动相、溶剂等建立定量方法。

注意：

前期我们一定要根据目标物的稳定性、溶解性，选择合适的溶剂来溶解样品及目标化合物；对于不稳定的样品，我们可以选择用流动相的初始比例做溶剂。

中性化合物无需调整流动相的pH值；而对于含酸碱性官能团的化合物，则需要用缓冲溶液调整流动相的pH值。

二选择合适的仪器和设备

2.1 结合文献和目标化合物的检测限选择适当的仪器。如文献中目标化合物在常规检测器（紫外/荧光）和质谱（三重四级杆）中均能检测，根据目标化合物的检测限选择仪器。

2.2 紫外/荧光检测器的检测限一般在（0.1-0.5）ppm（ug/ml），质谱（三重四级杆）的检测限一般在（0.1-1）ppb（ng/ml），每个物质的检测限会存在一定的差异，上面的检测限是我在做实验过程中大部分物质的区间，仅供参考，实际检测限根据物质的实际结果来定。

2.3 紫外/荧光检测器需知道目标化合物的吸收波长等信息；质谱需知道目标化合物、基质主要成分的化学式以及结构等信息。

三、优化质谱参数（只针对质谱检测器）

3.1 无论是单四极杆还是三重四极杆，我们都需要先优化质谱参数，找到目标化合物及基质主要成分的母离子、子离子、最优碰撞能CE和去簇电压DP，每个仪器的参数上存在一定的差异，但其基本的理论都是相似的，根据你使用的仪器设置、优化相关的参数。

3.2 在优化参数的过程中，发现物质的响应很低，我们可以增大目标物质的浓度，一般（0.5-1ppm），但尽量不要超过10ppm，浓度太大直接进入质谱容易污染质谱；在溶剂中加入适量的甲酸、乙酸铵等增加目标物质离子化等方式。

四、选择适当的溶剂体系及色谱柱

4.1 参考文献或根据目标化合物的性质选择合适的有机溶剂和水相组合。反向液相系统常用的有机溶剂甲醇/乙腈，甲醇相对来说价格更便宜，但甲醇的基线高于乙腈，且甲醇的压力会大于乙腈，所以两者根据你的实验条件选择；常规检测器水相一般加入（磷酸、乙酸、乙酸铵、磷酸缓冲盐）等，质谱检测器水相一般加入（甲酸、甲酸铵、氨水）等挥发性或弱酸碱性试剂等。主要根据物质的性质来调节流动相的pH。

4.2根据仪器的最大压力以及柱子的最大压力，且结合物质的性质来选择色谱柱。有的仪器压力以psi或Bar来计，需要进行单位换算，1Mpa=10Bar=145psi，下面介绍我们常用液相的区别。

4.2.1 HPLC高效液相色谱：扩散体积>30μL，最高耐压<6,000psi的液相色谱系统，最适宜色谱柱粒径是5μm；

4.2.2 UHPLC超高效液相色谱：扩散体积15 -30 μL，最高耐压≥9,000psi的液相色谱系统，最适宜色谱柱是粒径粒2-3.5μm的实心核颗粒色谱柱；

4.2.3 UPLC（超效能液相色谱，这中文名字是笔者自己取的，还麻烦大家再取个合适的名字）：扩散体积<15 μL，最高耐压≥15,000psi的液相色谱系统，最适宜色谱柱粒径是 <2μm；

五、调整流动相的组成、流速和温度

5.1 用确定的溶剂将目标物质和基质配制成一个浓度相对较高的样品，液相一般10-20ppm，液质0.2-0.5ppm，优化柱温、流动相梯度等其他色谱条件以实现最佳分离效果。将目标物质和基质配制在一起，排除基质对目标物质的影响，尽量将基质的主要成分和目标化合物分开，质谱记得在目标化合物出峰后，将基质的主要成分切换到废液，浓度太高进入质谱容易污染四极杆等组件，维护、清洗都会很麻烦。

系统性优化：采用系统性的方法进行条件的优化，一次只调整一个参数。

六、建立方法

根据优化的条件建立标准分析方法。进行方法验证，包括准确性、精密度、线性范围、检测限、定量限、溶液稳定性、耐用性、系统适用性等参数的验证。

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hujiangtao

第1楼2024/09/12

应助达人

18号有双倍积分呢

0

zhangyongmei

第2楼2024/09/12

好的呀！为了双倍积分都要再搞几篇出来
hujiangtao(hujiangtao) 发表:18号有双倍积分呢

0

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