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高效液相色谱|酸碱平衡的小知识

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2024/09/13

液相色谱（LC）

高效液相色谱（HPLC）中的酸碱平衡是指在色谱分析过程中，通过调节流动相的pH值来控制可离子化化合物的电荷状态，进而影响这些化合物在色谱柱上的保留行为和分离选择性。
较低的疏水性(较高的极性)会缩短中性样品在 RPC中的保留时间。离子化(例如使中性物质带有电荷)会显著提高酸或碱的极性或亲水性，从而导致该物质在 RPC 中的保留因子 k 降低 90% 甚至更多:

疏水性(在 RPC 的保留程度更高)，亲水性(在 RPC 的保留程度较低)

图1中是保留时间与 pH 以及样品离子化程度之间的函数关系，并以模拟分离羧酸 HA( 图1的实线)和脂肪胶 B( 图1的虚线)的混合物为例予以说明。K 值随着离子化的程度增加而减小，当 pH=pKa (或[ H⁺ ]=Ka)时，化合物的离子化比例为 50%。（蛋白的pI值在pKa附近易产生沉淀）

图1.保留时间与 pH 以及样品离子化程度之间的函数关系
图2是不同pH条件下分离酸 HA 和碱 B 的过程，当 pH 从4上升到10的时候，酸 HA( 阴影峰)离子化的程度更高，从而使保留时间缩短，与此同时，碱 B 因 pH 提高而减少离子化，延长了保留时间(在 pH=7 时，每个峰的 k 值均为 0.1)。从此例子可以看出，在分离含有酸和(或)碱样品的时候，改变流动相的 pH 可以很有效地控制分析物的保留时间(选择性)。

图2.分离酸 HA 和碱 B 的过程中，保留时间对应流动相 pH 的函数
01.高效液相色谱中酸碱平衡主要应用于哪几个方法？
1）反相色谱（Reverse Phase Chromatography, RPC）：这是最常用的HPLC模式，通常使用C18或C8色谱柱。在RPC中，通过调节流动相的pH值，可以改变可离子化样品组分的电荷状态，进而影响其在色谱柱上的保留行为。
2）离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography, IEC）：在IEC中，样品组分根据其电荷与固定相上的电荷相互作用而分离。调节流动相的pH可以改变样品组分的电荷状态，从而影响其与固定相的相互作用强度。
3）亲水作用色谱（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC）：在HILIC中，极性样品在水富集的固定相上保留，而非极性溶剂作为流动相。调节流动相的组成和pH可以影响极性样品的保留和分离。
02.调节流动相pH分离几种酸性混合物或碱性混合物的示例
图 3a 表示的以保留时间对流动相 pH 作图，分离的混合物中含有五种溶质：组分 1 为水杨酸(一种酸性较强的羧酸)，组分 2 是苯巴比妥(一种弱酸)，组分 3 是非那西汀(在此 pH 范围内为中性)，组分 4 是烟碱(一种弱碱)，组分 5 是甲基苯丙胶(一种强碱)。图3（b~e）表示的是不同 pH 所对应的色谱流出图。值得注意的是，强碱性的组分别打阴影的峰)保留时间的相对(和完全)变化；当 pH增加时，组分 5 的离子化程度会减小，保留时间延长。

图3.RPC 流动相 pH 与不同类型溶质保留时间之间的函数关系。组分1 为水杨酸，组分 2 是苯巴比妥，组分3 是非那西汀，组分 4 烟碱和组分 5 为甲基苯丙胶(阴影峰)
03.调节流动相的 pH 可以优化色谱的选择性和分离度，如果分离的重现性较差，是pH的选择不当么？

答：调节流动相的pH是优化HPLC中色谱选择性和分离度的重要手段，特别是当分离重现性较差时，可能是由于pH选择不当造成的。可以通过以下的手段进行改善：

1）了解样品的pKa值：选择流动相pH值时，应先了解被分析物的pKa值。调节流动相的pH值高于或低于pKa两个单位，有助于获得好的、尖锐的峰，因为这时化合物中99%以一种形式存在。

2）缓冲液的选择：缓冲液的选择应基于其pKa值与流动相pH的匹配度、溶解度和紫外吸收特性。缓冲液的pKa值与流动相pH相等时，缓冲能力最大，相差越大，缓冲能力越差。

3）pH对峰型的影响：当流动相pH与化合物的pKa接近时，可能会导致分子与离子形式共存，从而影响峰型。建议将pH控制在化合物的pKa±2的范围以外，以获得更尖锐的峰。

4）pH对选择性的影响：流动相pH值的微小变化对分离的选择性有显著影响，尤其是当pH接近pKa值时。在这种情况下，即使是0.1个pH单位的变化也可能导致分辨率的显著变化。

5）pH的精确控制：在实验室中，为了获得良好的分离重现性，需要对流动相pH进行精确控制，通常建议控制在±0.1个单位以内。
04.如何确定样品的pKa值以选择合适的pH范围进行色谱分离？
答：1）文献查询：对于已知化合物，可以通过查阅文献或数据库获取pKa值。
2）化学结构预测：如果无法在数据库中找到相关信息，可以根据化合物的结构和已知类似化合物的pKa值进行预测。例如，常见的脂肪族羧酸pKa值约为5，胺类化合物的pKa值约为9 。
3）电位滴定法：这是一种常用的实验方法，通过记录一定温度下，累积加入碱的体积和每加入一定体积的碱后所测得的溶液pH值，然后通过作图得到物质的pKa值。
4）分光光度法：基于物质的分子状态和离子状态对某一波长光的吸收度不同，通过测量一系列不同pH值溶液的吸光度数据，可以计算得到pKa值。

总结一下：

根据化合物的pKa值选择流动相的pH范围，通常建议将pH控制在化合物的pKa±2的范围以外，以确保化合物99%以分子或离子形式存在，从而获得更尖锐的色谱峰。同时，为了更好地控制保留行为的重现性，需要控制缓冲液的pH在±0.1个单位以内。

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