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PCR实验及数据分析和DNA电泳protocol

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2024/10/08

PCR实验及数据分析

l 实验原理: 聚合酶链反应(PolymeraseChainReactionm,PCR)是一项体外基因扩增技术,是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增DNA达100万倍以上。

l 实验体系:

a) 普通PCR

PCR master mix

5ul

Primer mix(10M)

0.8ul

cDNA

0.8ul

Dnase-free water

3.4ul

反应条件 Step1: 95℃ 30s

Step2: 95℃ 5s

60℃ 30s 40cycles

b) miRNA PCR

PCR master mix

5ul

F primer(10M)

0.25ul

Universal primer(10M)

0.25ul

cDNA

1ul

Dnase-free water

3.5ul

反应条件 Step1: 95℃ 30s

Step2: 95℃ 5s

60℃ 30s 40cycles

l 数据分析

采用2^-ΔΔCt来表示相关基因表达量，计算方法如下：

例：比较目的基因在A,B两种细胞里的表达量。

1、ΔCtA=Ct 目的基因 – Ct 内参；ΔCtB=Ct目的基因 – Ct内参

2、ΔΔCt=ΔCtA – ΔCtB

由此，目的基因在A细胞内的表达是在B细胞内表达的2^-ΔΔCt倍。
DNA 琼脂糖凝胶电泳

1.胶制备：根据目的片段大小制备相应浓度的凝胶（琼脂糖、1XTAE）;

凝胶浓度

0.5%

0.8%

1%

2%

分离片段大小

10000-20000bp

7000-10000bp

500-7000bp

100-500bp

2.微波炉加热使琼脂糖完全溶解在TAE中（溶液变清澈）；

3.稍待液体冷却后小心加入EB（100ml/5ul），摇匀，最好不要产生气泡，然后将液体倒入提前洗好的凝胶槽中，冷却30min胶可成型；

4.然后小心垂直拔出插槽，将胶小心取出，置于电泳仪内，电泳仪内加入1XTAE将胶淹没；

5.上样：将样品与5x loading buffer混合均匀后小心加入点样孔，在最后加入marker；

6.盖上盖子，检查电泳仪，注意应保持凝胶的起始端与电泳仪黑色线端一致；

7. 120V, 50min;

8.电泳完后，取出凝胶，置于凝胶成像仪成像。

注意：EB是强致癌物，实验过程中必须带PE手套，使用完后的胶及垃圾一定及时清理。

1x TAE由50x TAE稀释而来

50X TAE配置：以配制1L为例

Tris Base 242g ，冰乙酸57.1ml，0.5M EDTA(pH=8.0)100ml置于1L 烧杯中，加入去离子水，混匀，待完全溶解后用去离子水定容至1L，室温避光保存。

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