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高效液相色谱基础篇|关于色谱柱再生的小知识

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2024/10/14

液相色谱（LC）

今天讲一讲有关色谱柱再生的过程，色谱柱在吸附样品时，样品中所含有的盐、脂质、疏水蛋白质和其它一些生物物质都有可能与色谱柱发生相互作用，一些保留值较小的物质如盐类比较容易被冲出色谱柱，而一些保留性较强的组分，流动相溶液不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。当这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使固定相改变分离机理，以致样品保留时间会波动，会出现拖尾现象。我们就会对使用时间较长、柱效逐渐下降的色谱柱进行快速再生，以除去微量不洁杂质在柱头的聚积。

01.再生的目的

1）去除污染物：样品中的杂质，如盐、脂质、蛋白质等，可能会与色谱柱的固定相发生相互作用，并在柱头积累，导致峰形变差、保留时间变化、柱压升高等问题。通过再生可以去除这些污染物。
2）恢复柱效：随着使用时间的增长，色谱柱的分离效率可能会下降。再生处理可以通过使用特定的溶剂序列来恢复柱子的理论塔板数和选择性，从而改善柱子的分离性能。
3）延长柱子使用寿命：适当的再生可以延长色谱柱的使用寿命，避免频繁更换色谱柱，从而节约成本。

02.再生的方法（仅参考）

一般色谱柱的厂家说明书上都会有再生的方法指导，大家也可以参考厂家说明书的方法来做。
1）反相色谱柱：（每一步至少使用10个柱体积的溶剂，且断开检测器冲洗）
a. 使用不含缓冲液的流动相进行预冲洗，去除大部分残留样品和缓冲盐。
b. 使用高比例的有机溶剂（如100%甲醇或乙腈）进行冲洗，以去除大多数的污染物。
c. 使用75%乙腈和25%异丙醇的混合溶剂进行冲洗，以进一步去除中等极性污染物。
d .使用100%异丙醇冲洗色谱柱，以去除更强极性的污染物；如果必要，可以采用100%二氯甲烷或100%正己烷等更强溶剂。使用强烈溶剂后，通常以异丙醇作为过渡溶剂，最后用初始流动相重新平衡色谱柱，再进行测试效果。
e. 对于严重污染的色谱柱，可以考虑使用二甲基亚砜（DMSO）或者二甲基甲酰胺和水的混合物进行冲洗。（注：有时为了完全再生色谱柱，可能需要使用梯度系统过夜进行溶剂冲洗。）
2）正相色谱柱：（每一步至少使用10个柱体积的溶剂，且断开检测器冲洗）
a. 使用流动相中的弱溶剂进行预冲洗，如正己烷或氯仿等，以低流速开始冲洗色谱柱，直至柱压稳定。
b. 接着使用更强的溶剂，如二氯甲烷或异丙醇等，进行冲洗。
c. 使用100%异丙醇进行冲洗，其极性和正相洗脱能力通常足以清除柱上的所有残留物。
d .完成上述步骤后，需要使用与分析相同的流动相平衡色谱柱，再进行测试效果。
3）体积排阻色谱柱：（每一步至少使用10个柱体积的溶剂，且断开检测器冲洗）
a. 使用流动相不含缓冲液进行冲洗，以去除大部分残留样品和缓冲盐。
b. 使用较低比例的有机溶剂与水的混合溶剂，如50%乙腈/水或50%异丙醇/水，进行冲洗。（以色谱柱能耐受的有机相为主）
c. 使用100%水进行冲洗，以去除残留的有机溶剂和其他水溶性污染物。
d .完成上述步骤后，需要使用与分析相同的流动相平衡色谱柱，再进行测试效果。
4）离子交换色谱柱：（每一步至少使用10个柱体积的溶剂，且断开检测器冲洗）
a. 使用与流动相相同但盐浓度更低的溶液冲洗色谱柱，以去除残留的样品和缓冲盐。
b. 使用流动相盐浓度5-10倍的溶液冲洗色谱柱，通常不超过1M，以去除强吸附的离子性物质。
c. 使用100%水冲洗色谱柱，以去除残留的盐分和有机溶剂。
d .完成上述步骤后，需要使用与分析相同的流动相平衡色谱柱，再进行测试效果。
4）HILIC色谱柱：（每一步至少使用10个柱体积的溶剂，且断开检测器冲洗）
a. 使用高比例水相的流动相进行冲洗，以去除残留的有机溶剂和其他水溶性污染物。例如，可以先用50/50的乙腈/水冲洗色谱柱以去除极性污染物。
b. 使用高比例有机溶剂如95%乙腈进行冲洗，以去除大多数的污染物。如果需要更强的清洗效果，可以使用纯乙腈进一步冲洗色谱柱。
c .完成上述步骤后，需要使用与分析相同的流动相平衡色谱柱，再进行测试效果。

03.再生的注意事项

1）仔细阅读说明书：在再生之前，仔细阅读色谱柱的使用说明书，了解制造商推荐的再生方法和溶剂。
2）正确安装色谱柱：确保色谱柱正确安装在液相色谱系统中，流向箭头与流动相流向一致；如果堵塞严重的话，可能需要反接再生。
3）避免干柱：防止色谱柱干燥，因为干燥可能导致填料结构变化，影响柱性能。
4）使用兼容溶剂：使用与色谱柱兼容的溶剂进行再生，避免使用会引起柱填料破坏的溶剂。
5）控制流速：在再生过程中，逐渐增加流速，避免一开始就使用高速，这可能会对柱床造成冲击。
6）再生后确认：再生后，通过运行测试样品来检查色谱柱的性能，确保再生效果。注：一般都到再生了，就要承担再生不好的风险；如果折腾几天也没好的话，建议直接换新的色谱柱。

总结一下：

色谱柱再生，就好比给老旧的发动机做一次大修，目的是清除那些顽固的污染物，比如盐分、脂质和蛋白质，它们喜欢赖在柱子上不走，搞得峰形变差，保留时间飘忽不定，柱压还噌噌往上涨。

再生的手法得根据不同的色谱柱类型来，比如反相柱可能需要甲醇或乙腈这样的有机溶剂洗个澡，而离子交换柱可能就得用高盐浓度的溶液来搓一搓。关键是要温柔对待，别让柱子干着，也别用太猛的溶剂，免得伤了柱子的“元气”。

最后，再生完要检查一下，看看性能恢复得如何，如果还是不行，那可能就是柱子真的老了，该换新的了。

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