生物分析方法

多肽一般是由100个以内氨基酸通过肽键连接而成的一类化合物，通常具有二级结构。自上世纪20年代胰岛素疗法问世以来，多肽药物一直在医药领域发挥了重要的作用，相比于小分子药物，多肽药物在生物活性和特异性方面比较高，同时稳定性方面比蛋白质药物较好。随着生物技术的不断发展，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床，因适应证广、安全性高且疗效显著，多肽药物目前广泛应用于肿瘤、糖尿病、艾滋病、细菌真菌感染、免疫、心血管、泌尿等方面。▲糖尿病药物利拉鲁肽的氨基酸序列图和药物产品图早在2017年FDA发布的”Impact Story”栏目中的一篇文章就提到，目前全球将近有100种上市的多肽药物，全球销售额约在150-200亿美元。研发新的多肽药物以及多肽类仿制药都面临着巨大的机遇和挑战。FDA收到的关于多肽药物新的适用症申请正在快速增加，同时仿制药的出现也正加速多肽药物的发展。然而为了确保仿制药与原研药的质量和疗效一致性，开发稳定的多肽药物分析和表征方法变得尤为重要。FDA的药品评价和研究中心（CDER）的专家们认为质谱（MS）技术是分析多肽药物非常关键的一项技术。结合液相的色谱分离和质谱的检测，LCMS方法因其良好的专属性、高灵敏度、更宽的动态范围、以及更高的准确度和精密度，现已广泛用于多肽药物的分析方法开发中，尤其是含有生物基质的分析方法开发。同样LCMS方法也适用于多肽药物临床使用阶段的药物监测。▲岛津三重四极杆液相色谱质谱联用仪的巅峰之作但是相比于其他小分子药物，多肽因其具有吸附性以及分子量较大的特点，因此在样品的储存、预处理以及色谱柱的选择、仪器方法的开发等方面带来了更大的挑战。尤其像多肽容易吸附到固体表面，最终可能导致浓度测量的偏差，通常推荐低吸附的材质产品来保存多肽药物。在多肽药物的生物分析方法开发中，还有一个非常重要问题就是内标（IS）的选择。内标在保证LCMS方法的准确度和方法稳健性方面起着至关重要的作用，选择稳定同位素内标用于LCMS生物分析方法也逐渐成为“金标准”。考虑多肽药物生物分析方法的复杂性，选择稳定同位素内标时更是优先推荐选择含13C标记及标记数量更多的内标！岛津在药物生物分析领域除了提供仪器和消耗品外，还开发了高品质稳定同位素内标产品。下表介绍了常见的多肽药物对应的稳定同位素内标产品。多肽药物（适用证）稳定同位素内标货号特立帕肽（骨质疏松）Stable Isotope Labeled TeriparatideSVSEIQ{Leu(13C6,15N)}MHNLGKH{Leu(13C6,15N)}NSMERVEW{Leu(13C6,15N)}RKK{Leu(13C6,15N)}QDVHNFSC1208-1丙氨瑞林（子宫肌瘤）Stable Isotope Labeled Alarelin{pGLU}{His}{Trp}{Ser}{Tyr}{D-Ala}{Leu(13C6,15N)}{Arg}{Pro}-NHEtSC1208-2艾塞那肽（2型糖尿病）Stable Isotope Labeled ExenatideHGEGTFTSDLSKQMEEEA{Val(13C5,15N)}R{Leu(13C5,15N)}FIEW{Leu(13C5,15N)}KNGGPSSGAPPPSSC1208-3利拉鲁肽（2型糖尿病、肥胖症）Stable Isotope Labeled LiraglutideHAEGTFTSDVSSYLEGQAA{Lys(gamma-Glu-palmitoyl)}EFIAW {Leu(13C6,15N)}{Val(13C5,15N)}RGRGSC1208-5亮丙瑞林（前列腺癌）Stable Isotope Labeled Leuprorelin{pGLU}{His}{Trp}{Ser}{Tyr}{D-Leu}{Leu(13C6,15N)}{Arg}{Pro}-NHEtSC1208-6奥曲肽（肢端肥大症）[2H8]-Octreotide acetateC4840加压素（尿崩症）[2H7]-Vasopressin acetateC5126去氨加压素（尿崩症）[2H5]-DesmopressinC5013万古霉素（抗菌）[2H12]-Vancomycin TFA saltC3831卡泊芬净（抗真菌）[2H4]-Caspofungin diformateC6237达托霉素（抗菌）[2H5]-Daptomycin trifluoroacetic acid saltC3801米卡芬净（抗真菌）[13C6]-Micafungin sodium saltC5771可比司他（HIV感染）[13C4,2H3]-CobicistatC5634环孢菌素（免疫抑制）[2H12]-Cyclosporin AC1273硼替佐米（多发性骨髓瘤）[2H8]-BortezomibC3667卡非佐米（多发性骨髓瘤）[2H8]-CarfilzomibC3944除了以上产品，岛津还提供多肽药物定制合成稳定同位素内标产品。所有内标均提供HPLC、LCMS、NMR详细检测数据。号外号外，优惠活动来了！即日起至2020年12月31日，凡购买多肽稳定同位素内标产品，即可申请一套低吸附样品瓶！下期预告：抗体药物生物分析试剂盒

v AOAC批准MALDI Biotyper 方法作为沙门氏菌属、克罗诺杆菌属和其它革兰氏阴性菌确认和鉴定的官方分析方法。v AOAC批准MALDI Biotyper 方法作为单增李斯特菌、李斯特菌属和其它革兰氏阳性菌确认和鉴定的官方分析方法。2018年2月14日位于美国马萨诸塞州Billerica的布鲁克总部发表新闻公告，宣布MALDI Biotyper微生物鉴定方法已经通过AOAC国际认证，成为确认和鉴定致病和非致病微生物的两个官方分析方法 (OMA)。这两个方法适用于一些最常见的食源性致病菌，包括沙门氏菌属、克罗诺菌属、李斯特菌属和单增李斯特菌，以及其它细菌的鉴定。菌种的确认和鉴定可以直接从食品微生物广泛使用的选择性培养基进行，也可以从任何非选择性培养基进行。MALDI Biotyper作为一种快速低成本的微生物鉴定方法，已经在食品安全机构、食品企业和食品检测机构获得广泛应用。它可以大大提高食品检测实验室的效率，缩短食品企业的质控周期。验证研究证实MALDI Biotyper可以直接从培养皿上确认和鉴定微生物，适用的培养基包括FDA、ISO和USDA等机构推荐的选择性培养基、一些显色培养基和任何非选择性培养基。获得批准的MALDI Biotyper系统还有另外一个型号MBT smart，配备了专利的频率更快的smartbeam™ 激光器，可以进一步加快分析速度，缩短分析时间。MALDI Biotyper Subtyping分型模块可以高度可信地区分李斯特不同种。以光学引导样品制备的MBT Pilot™ 和批量自动添加基质的MBT Galaxy™ ，则进一步提高分析效率和工作流程的标准化。采用布鲁克AnchorChip™ 专利技术的MBT Biotargets 96靶板，可以进一步优化系统性能。 Q Laboratories的首席科技官Erin Crowley说：Q Laboratories非常荣幸成为这两项OMA验证研究的专家实验室，这些项目的成功实施得益于MALDI Biotyper简易的工作流程。我们实验室已经采用MALDI Biotyper一年半了，这项真正的创新技术通过AOAC国际认证成为OMA方法，为我们的客户提供了作出关键性结果判定前所需要的快速准确的微生物鉴定和确认方法。布鲁克公司工业微生物部门的业务拓展经理Daniele Sohier博士说，与AOAC和Q Laboratories的合作非常愉快，非常高效，我们在短短6个月时间内就获得这两项OMA认证，充分说明MALDI Biotyper作为快速准确的微生物确认和鉴定系统是多么可靠和强大。MALDI Biotyper已经广泛用于临床微生物领域，这两项认证又进一步为我们打开了食品微生物这一广阔市场。 基本说明：1. AOAC (Association of Official Analytical Chemists) 美国官方分析化学家协会AOAC成立于1884年，是一个世界公认的，独立的三方非盈利组织，致力于食品和农业领域分析方法验证和认可, 提供可信赖的分析检测方法，是国际公认的金标准验证者和颁布者。AOAC附属机构AOAC研究中心 (RI) 是一个独立的第三方非政府机构，负责AOAC对唯一或替代方法的验证评估程序，评估程序分两种类型：Performance Tested (PTM) 和Official Methods of Analysis (OMA)。2. Performance Tested (PTM) 是AOAC基础的认证程序。主要目的在于评估方法的性能特性，或作为申请更高可信度或方法重复性验证（如OMA）的基础认证。PTM属于方法开发者的验证研究，通常由方法开发者在自己的实验室完成基本性能和方法兼容性、排他性、以及可靠性的单一实验室验证验证。3. Official Methods of Analysis (OMA) 是AOAC重要的认证程序，其中包括三部分：SLV (Precollaborative Validation) Study 单一实验室验证（预协同验证）研究，通常由方法开发者实验室完成，包括兼容性和排他性实验。SLV验证数据是正式提出OMA申请的必要前提条件。Independent Validation Study 独立验证研究，是验证方法开发者提供的数据，由方法委员会确认方法，并由受过培训的独立实验人员在独立实验室完成。Collaborative Validation Study 协同验证研究，是在不同实验室间进行性能验证和方法重现性的验证。需指定至少来自6个实验室的12位独立操作人员，由方法委员会指定菌种下发样品，所有实验应同时进行。OMA认证程序的科学严谨性和审查系统性是国际公认的，所以通过OMA验证的方法具有业内认同的可信度和公信力，是高级别的正式官方分析方法。4. Q Laboratories是获得ISO/IEC 17025认证的实验室，为全球公司提供全面的微生物、分析化学和研发实验服务。自从1996年以来，一直服务于众多的食品、药品、化妆品、食品添加剂和个人护理用品企业，是AFNOR、AOAC和MicroVAL三个主要认证机构认可的北美地区首个专家实验室。

p 　 a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　与 span style=" COLOR: rgb(255,0,0) TEXT-DECORATION: underline" strong 化学仿制药 /strong /span 相比， span style=" COLOR: rgb(255,0,0) TEXT-DECORATION: underline" strong 生物类似药 /strong /span 虽然也属于仿制药范畴，但其不仅投资门槛更高，技术门槛也更高。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　 strong 三大技术门槛 /strong /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　生物类似药的技术门槛高至少表现在三大方面： /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　一是有关生产、制造过程和工艺流程。在产品生产过程中，有多种因素可能会影响到生物类似药的质量，如分子设计、表达系统、细胞株类型、翻译后修饰(PTM)、不纯物和污染物、配方和辅料、包装容器、生产过程中的蛋白降解等。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　二是对生物类似药在质量、安全性和有效性(QSE)等方面进行分析检测、表征，需要在临床试验前在蛋白的多种性质上与原研药参考品一致。这种一致性，根据欧盟EMA的要求需要“相似”(similar)。而根据美国FDA的要求则需要“高度相似”(highly similar)。如果是可以自动替换(interchangeable)的生物类似药，其要求更高。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　上面两大高门槛对于中国药企而言更是意味着投资的高门槛，因为无论是上下游的工艺开发、生产还是分析方法开发、质量检测，所需仪器设备甚至耗材几乎都需要进口。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　第三个方面是生物原研药的专利壁垒。生物药的专利要远比化学药复杂，这个高门槛很容易被投资人忽视。艾伯维(Abbvie)和安进(Amgen)因Humira(修美乐)的生物类似药的专利之战仅仅是一个例子。现在风头正劲的免疫肿瘤抗体药(尤其是已经上市的两个PD-1抗体药)以后很可能成为被仿制的热点目标，但免疫肿瘤领域近期多起专利诉讼也说明：即使是做原研生物药，专利问题也需要防范。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　出于工作关系和个人兴趣，笔者本文仅谈谈生物类似药的分析技术。如表格所示，生物类似药的表征分析，涉及许多生物化学和生物物理技术，笔者对于大多数技术略知一二，本文无意具体谈这些分析技术的细节和难度，而只是通过简单评论这些技术手段，试图说明进入生物类似药的门槛很高。 /a /p p style=" TEXT-ALIGN: center" a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" img title=" biosimilar4-table.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201604/insimg/f1990612-cf0d-4d5d-951c-85bb88d8965b.jpg" / /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　 strong 质控蛋白三大性质 /strong /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　与评价化学药类似，对于生物药的评价，质量、安全性和有效性可以说是最重要的三个方面，而质量又是安全性和有效性的前提和基础。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　对于生物药的质量，FDA认为治疗性蛋白的三大方面性质虽然不能被完全充分测定，但对于评价蛋白药是非常重要的，这三大性质即：PTM、蛋白高级结构和蛋白聚集，下面将分别简单介绍。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　 span style=" TEXT-DECORATION: underline" 蛋白的翻译后修饰(PTM) /span /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　蛋白的翻译后修饰(PTM)有很多种，常见的包括糖基化(又可细分为：半乳糖苷基化、岩藻糖基化、唾液酸糖苷化等)、氧化、磷酸化、硫酸化、脂化、二硫键形成和脱酰胺。这些化学变化大多是在细胞内发生的，但有些也可能发生在生产的各个阶段(如纯化和储存过程)。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　现在的科学研究已经表明，蛋白的PTM会影响蛋白的活性和免疫原性。蛋白的PTM还可能改变蛋白的结构进而引起聚集，从而进一步影响蛋白的免疫原性。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　因此，需要在蛋白类药物生产的各个阶段对蛋白质的PTM进行检测。对于单一成分的纯化蛋白药，PTM的检测和监测则相对容易一些。而对于含有许多种蛋白质的复杂混合物蛋白药物(如有些预防性疫苗)，即使是采用蛋白质组学技术，检测所有蛋白的PTM也是非常大的挑战。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　研究蛋白PTM的最有力的利器当是生物质谱了，主要是基于电喷雾(ESI)和基质辅助激光解离(MALDI)两种技术。近年来，质谱在生物类似药领域的应用明显增多，在近几年的美国质谱协会会议上，每年都有不少口头报告或墙报是直接用质谱研究生物类似药PTM的，其中糖基化研究占比最大。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　但是，由于生物质谱价格昂贵，动辄几十万美元，高端的售价甚至在50万美元以上，这也限制了生物质谱在包括生物类似药在内的生物制药领域的应用。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　 span style=" TEXT-DECORATION: underline" 蛋白的高级结构 /span /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　蛋白的高级结构是指蛋白的二级、三级和四级结构，这些结构特性决定了蛋白的三维空间结构，进而最终决定了蛋白的功能和活性。因此，比较生物类似药(指蛋白药)和原研药的蛋白高级结构，是证明两只药相似的重要手段。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　X-射线衍射和核磁共振(NMR)是公认的测定蛋白质三维空间结构的两种最主要的技术。但是，对于生物类似药和原研药的结构相似性研究，这两种技术都有很大的挑战。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　对于X-射线衍射而言，需要耗时较长的蛋白结晶过程和数据解析过程，对于样品量较大的工业界而言，显然不能满足高通量的要求。而NMR不但价格昂贵、灵敏度相对较低、数据分析耗时长，对于分析分子量达150kDa的大分子抗体药也面临很大的挑战，所以NMR在生物类似药领域注定应用非常有限。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　另外，还有其它一些经典生物物理技术被用于表征蛋白的结构，如圆二色性谱、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱、差示扫描量热法、分析超速离心、排阻色谱以及各种染料结合鉴别技术等。这些技术一个最主要的限制，就是只能检测来自蛋白不同部位的某一种总的信号。从这些测定得到的信息只能得到生物药整个结构的总的平均值。比如：圆二色性谱测定就只能表明某一种主要的二级结构(阿尔法螺旋、b折叠和无规卷曲)的平均百分比。如果一个含有多个阿尔法螺旋结构的蛋白，其中只有一个阿尔法螺旋结构和另一蛋白相比发生了变化，但是即使这一变化相对较大，被另外不变的阿尔法螺旋平均以后，圆二色性谱所能测到的变化也可能很小，甚至没有可以测量出的变化。所以这些经典生物物理技术不能用于检测生物药很小的结构变化。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　更灵敏的技术则是氢氘交换质谱(HDX-MS)，这也进一步显示质谱技术在比较生物类似药和原研药结构方面的重要性。现代生物质谱技术在生物药领域的应用已经远不仅仅是做蛋白质鉴定、分子量测定、氨基酸序列测定，蛋白结构只是其多种新应用的一个方面。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　 span style=" TEXT-DECORATION: underline" 蛋白聚集 /span /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　蛋白聚集是蛋白药生产过程中很头疼的问题，尤其是对于高浓度的蛋白溶液，很容易引起蛋白聚集。单体蛋白的聚集过程可以是可逆的，也可能是不可逆的，其聚集后的大小可以从二聚体到包含上万亿个蛋白单体的肉眼可见的颗粒。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　总的来说，蛋白聚集对于任何蛋白药都是问题。蛋白聚集不但会降低蛋白药的有效剂量，更大的问题是可能会引起毒副作用和免疫反应。一般而言，蛋白分子量越大，其免疫原性越强。在某些特殊情况下，这些难以预料的副作用甚至可能是致命的。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　因此，蛋白聚集必须被检测、定量和表征，用以比较生物类似药和原研药。如表中所示，表征蛋白聚集的主要分析技术包括排阻-高效(压)液相色谱(SEC-HPLC)、凝胶电泳、分析超速离心、光散射法等。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　由于简单、易用、廉价、快速、样品用量少等特点，SEC-HPLC是目前检测蛋白聚集的最常用方法。当然，SEC-HPLC也有自己的缺点，如较大的蛋白聚体可能在进样上柱时就被除去，造成假阴性。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　这也进一步说明，没有任何一种十全十美的分析技术。正是缘于此，美国FDA和ICH(国际人用药注册技术协调会议)都建议生物类似药研发企业不但要检测蛋白不同种性质，也建议采用多种技术检测同一种性质，以尽量得到更全面的生物类似药和原研药可以比较的多种信息，如理化性质、生物活性、免疫化学性质、纯度、不纯物和污染物等。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　 strong 相似度界定：Case By Case? /strong /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　值得一提的是，生物类似药有两个常用且易于混淆的概念：可比性(comparability)和相似性(similarity)。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　ICH明确定义和限制“可比性”是指同一家生产商所生产的原研药(包括批准上市后阶段)，在生产工艺变化(如放大)后，两种工艺所生产的同一产品(当然不可能100%相同)的可比性(参见ICH Q5E指导性文件：Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process，生产过程变化后生物工程/生物产品的可比性)。而“相似性”则是生物类似药生产商仿制的生物药与原研药生产商制造的参考品相比较而言的。 /a /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S22003-T000-1-1-1.html" target=" _self" 　　根据ICH的定义，“可比性”概念是不可用于生物类似药的。事实上，对于开发生物类似药的厂商而言，最大的困难显然不是上述两个易混淆的概念，可能一个最大的困难是生物类似药与原研药的相似度要多高才足够高，目前欧盟EMA和美国FDA已经出台的有关生物类似药的指导性政策文件都没有明确的界定，而由于生物药的复杂性和其本身的千差万别，也决定无法有明确的界定。所以欧盟EMA和美国FDA的有关文件中时常会出现“case by case”(具体问题具体分析)的字眼。 /a /p p br/ /p