生物分离纯化

p 　　 strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 超速离心的差速沉淀及等密度梯度离心法 /span /strong /p p 　　无论是国际顶级杂志的文献统计，还是国内用户的私下调研，超速离心一直都是作为外泌体或者说胞外囊泡分离纯化的金标准而存在。伴随着外泌体的发现、研究深入和产业转化，不断有各种“替代”方法、试剂盒出现，试图挑战超离在外泌体分离纯化方式中的领导地位，但至今仍未有成功。究其原因，超速离心也许是唯一一个可以同时用两个不同维度对外泌体进行分离纯化的实验方法。 /p p 　　每一种颗粒，例如外泌体，都会有其自身的一定特定属性，例如特定的大小区间、一定的密度范围、也许还有某些特别的表面标记物等等。以上每一种属性，只要能够与其他的颗粒存在足够的区分度，我们就可以相对应想办法进行识别和分离，这就构成了近百年来分子生物学的种种纯化手段。 /p p 　　以超速离心为例，其核心原理为沉降平衡方程： /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201806/insimg/0f433fe1-85c9-43f2-9e09-d27552a46652.jpg" title=" 1.png" / img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201806/insimg/ac34f1d2-2ece-4c7e-939b-988f7f3f7ce1.jpg" title=" 2.png" width=" 300" height=" 366" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" float: right width: 300px height: 366px " / 　　 /p p style=" text-indent: 2em " v为每个颗粒在离心过程中的瞬时移动速度，d是颗粒直径， σ是颗粒密度，ρ介质液密度，?介质液年度，ω2r为转速及所处离心半径 /p p 　　当两个或多个颗粒的直径d有显著差异时，其离心沉降速度也将会有较明显差别。直径大的颗粒很快就可以沉淀下来，而更小的颗粒需要更大的离心力或者更长的离心时间才可完成沉降。这就是我们最常用的差速沉淀的基本原理。例如10万xg离心1-3小时，就是最常见的把100nm左右的颗粒沉淀下来的实验条件。 /p p 　　但一种方法不可能是万能，当不同颗粒的大小比较接近时，基于大小的分离方法就会出现误差，把不同的颗粒都一起分离下来，虽然已经把过大或者过小的颗粒去除，但如果类似大小的杂质颗粒过多，实际上这也只能算是分离富集，而不能算作纯化。 /p p 　　为此，离心专家们又开发了另一种实验方案，人为地制造不同的介质液密度区间。基于上述沉降速度方程，每一个颗粒最终将会停留在跟它本身密度相同的位置。由于介质液按实验需要铺设成连续或不连续分布，最终不同样品也会根据密度的差异，形成不同的区间性分布。外泌体由于其脂膜结构(密度~1g/ml)包裹了一定量的核酸(密度1.4~1.7g/ml)及蛋白(密度1.2~1.4g/ml)，导致其平均密度区间为1.13~1.19g/ml左右(实测值)。通过铺设不同的介质液分层，例如通过不同浓度的OptiPrep/蔗糖/TE Buffer，我们就可以人为的仅把符合此密度区间的颗粒给筛选出来。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201806/insimg/d813137b-fb44-4826-b814-626f12a8d2ec.jpg" title=" 3.png" / /p p 　　不同的胞外囊泡，拥有不同的大小和密度分布区间，这类物理属性是我们在研究生物颗粒时最直观也是最准确的表观参数。超速离心法，正式通过大小和密度两个不同的维度，根据实验的需要，一步步地把我们所要重点研究的外泌体颗粒，从纷繁复杂的体液环境中、从不同的胞外囊泡中分离、富集和纯化下来。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201806/insimg/4f8ecfd3-926d-4a24-9385-f9f77097ef19.jpg" title=" 3.jpg" / /p p 　　下一期，我们将进一步对比分析其他基于试剂盒或其他实验原理的外泌体分离纯化方法，从中找出最适合我们不同实验所需的实验方案，以及超速离心为什么始终被认为是金标准的原因，敬请期待！ /p

科学家利用层析系统开发高效的蛋白分离介质。诺维信供图 　　注射疫苗出现副作用，使用血液制品感染疾病，热销的生物制品紧急召回……这样的消息接连见诸报端。这在国家生化工程技术研究中心(北京)首席科学家苏志国看来，出现上述问题的背后，可能都是生物分离纯化技术不过关在“捣鬼”。 　　“生物制药对纯度要求颇高，需要通过生物分离纯化技术将有害物质或杂质去除，但又不能破坏目标产物的活性，其过程十分复杂。”苏志国说，包括生物制药在内的生物技术各相关产业流程，到最后都绕不过分离纯化这一步。 　　业内人士更是形象地将分离纯化技术，比作为生物技术产业化的“最后一棒”，而跑过的人都知道这一棒的艰难程度。 　　不可替代的产业角色 　　根据业内人士的共识，生物技术有所谓的上、下游之分。习惯上，把由生物学家从事的工作，包括分子生物学、生物化学、生物物理学以及遗传、育种、细胞培养、代谢等的研究划分为上游技术，而把生物技术初级制品的进一步分离、纯化、精制，进而制成最终产品的过程统称为下游技术。 　　因此，生物分离纯化技术常常被称作生物技术的下游工程。 　　从工业流程上来看，分离纯化技术也是距离终端产品最近的关键一步。 　　在生物技术科研和生产过程中，存在着大量的蛋白质、多肽和核酸等生物大分子的分析、分离和纯化工作，需要高效快速的分析、分离和制备方法。 　　而生物分离纯化技术又有别于传统的化学分离方法。全球最大生物酶制剂生产商诺维信中国研发部高级经理吴桂芳向《中国科学报》记者表示：“与化学方法相比，生物分离纯化要保持生物分子的活性，通常需要低温、特定的酸碱度、渗透压等。” 　　苏志国进一步解释，化学分离法通常利用物质挥发度的不同，比如蒸馏、精馏，通过加热来分离 但对于生物分子，例如蛋白质，通过加热就容易失去活性，所以传统化工方法往往不适用于具有生物活性产物的分离纯化。因此，生物分离纯化技术具有不可替代的产业角色。 　　据吴桂芳介绍，在生物制品的生产流程中，分离纯化成本一般占总成本的60%以上，主要是因为分离过程中的选择性不高，有效成分损失多。对于一些对终产物纯度要求高的产品，分离步骤越多，产物的最终收率越低。 　　特别是用于临床的生物医药产品，不仅要达到很高的纯度，而且还要在分离过程中最大限度地保持其生物活性，因为一旦失活，不仅失效，甚至可能产生有毒有害物质。苏志国认为，不合格疫苗等生物制品在人体出现副作用，其背后往往存在生产企业生物分离纯化技术不过关的问题。 　　令学者又爱又怵 　　据苏志国观察，很多学生非常愿意学习生物分离纯化技术，甚至从其他专业“投奔”过来。“因为产业需求大，很多企业都需要这方面人才，毕业生好找工作。” 　　而与此形成鲜明对比的是，国内长期在这一领域从事研究的学者却并不多。 　　苏志国对《中国科学报》记者说：“有别于大多数基础科学研究，生物分离纯化技术的应用性很强，需要产业实践来检验，很难出理论成果，也不容易在国际一流期刊上发论文。” 　　该领域的科研人员还需要直面来自企业的压力。花了真金白银的企业不会在乎学者发了多少文章，而是看能不能解决产业化问题。因此，研究者对于从事生物分离纯化技术研究的矛盾心理也就不难理解了。 　　那么，生物分离纯化技术到底难在哪? 　　马宁宁来自北京义翘神州生物技术有限公司。该公司以蛋白和抗体生产见长，去年还被世界知名生物技术公司Life Technologies选为战略合作伙伴。身为研发副总经理的他对于生物分离技术之难深有体会。 　　据他介绍，生物活性物质对外界很敏感，具有天生的不稳定性，对分离条件要求高，从而限制了分离的手段，而同时其分离和纯化又是一个非常复杂的过程。 　　例如，生物合成的发酵液或反应液是很复杂的多相体系。它含有微生物细胞、细胞碎片、代谢产物、未用完的培养基等，杂质含量较高，而目标产物的浓度却非常低，常常不到百分之一甚至千分之一 有的杂质还具有与产物非常相似的化学结构及理化性能，很难去除 目标产物具有生理活性物质，极不稳定，遇热或遇某些化学试剂极易失活或分解，还容易受到环境微生物的污染，因此常常要求在无菌条件下进行分离纯化。 　　受制于人的局面必须打破 　　生物分离纯化的复杂性，直接导致了其工艺流程长、需要的设备多，对原材料要求高等特点。 　　而在生物分离纯化领域，我国生物产业却面临着受制于国外厂商的尴尬局面。 　　马宁宁表示，有些设备和原材料看似简单，但对精度和GMP规范符合程度的要求很高，国内还不能生产，只能从国外进口。 　　“例如色谱柱，国内产品精度和强度能达到生物制药生产要求的很难找到。”他对《中国科学报》记者说，“再比如分离介质，进口产品在国内的售价要比在原产国高出50%~100%。” 　　苏志国认为，这意味着我国具有战略意义的生物产业，其命脉却掌握在别国手中。“长期以来我国生物分离纯化关键技术、设备和部分原材料依靠国外引进，这是发展阶段所决定的，但我们若想实现生物技术新产品的创制，就必须打破这一局面。” 　　他建议，应加强生物分离纯化技术的基础研究，“因为基础科学是原动力，而如何在复杂系统中分离生物产品，其中某些科学规律还不清楚”。 　　而各个被访者均重点阐述的，就是要攻克在设备和原材料方面的难题，其中又以分离介质为甚。 　　吴桂芳表示，应针对特定的产品开发高选择性的分离纯化介质，从而缩短分离流程，提高产品得率。这需要材料学、化学、生物技术及化学工程的紧密合作，并与终端市场需求、生产企业需求的紧密结合。 　　据马宁宁观察，分离纯化介质虽然附加值高，但由于用量低，并且技术要求高，对于习惯生产低端大宗工业品的企业不具吸引力，还需依靠有技术优势的中小企业来开发，但这些企业又因规模小不受国家重视。 　　他认为，国家在选择扶持对象时，应该更多关注专于某个细分领域的小企业，“这样的企业非常重要，没有它们，现代化的生物技术产业链就无法建立，这些小公司不该被忽视”。 　　记者手记 　　产业化长跑不能倒在冲刺阶段 　　科技产品从基础研究到投放市场，会经历漫长的过程。如果把这比作长跑，那生物技术产业化就是马拉松。 　　这段时间记者接连跑了两家生物技术企业，其负责人无不感慨生物产业的煎熬：多少品种在中试阶段表现良好，结果一放大生产就功亏一篑。 　　而生物分离纯化正是产业化冲刺阶段的关键技术。 　　我们常说，不要输在起跑线上。经过近些年的努力，我国在生物技术基础研究上的成果可谓丰硕，已成为在国际顶级期刊上发表论文的常客。 　　而在距离产业化最近的生物分离纯化阶段，我们同样需要强大的合力共同攻坚。 　　与大多数基础科学不同，生物分离纯化技术研究的应用性很强，需要产业实践来检验，很难出理论成果，也不容易在国际一流期刊上发论文，不少学者望而却步或者来了又走。 　　那么，能不能针对这一特点调整科研评价体系，把更多优秀学者吸引过来呢? 　　生物分离纯化过程复杂，涉及多种设备和原材料，其中有些虽然附加值高，但由于用量低，并且技术要求高，对于习惯生产低端大宗工业品的企业不具吸引力，还需依靠有技术优势的中小企业来开发，但这些企业往往规模小，抗风险能力差，一个订单被国外抢走就可能倒闭。 　　它们就像机器上的一颗颗螺丝钉，易被忽视但又不可或缺。它们期盼扶持政策的甘霖。国家能否鼓励更多的中小企业专于某一细分领域，给起跑不久的它们推上一把，这样，生物产业的整体才能尽早抵达终点。

仪器信息网讯 近年来，全球医药市场的发展中心逐渐由小分子化学药转向大分子生物药，预计到2020年，全球生物医药的销售额将达到1400亿美元，生物医药的全球销售比重将超过三分之一。而各大跨国药企对生物制药的投入不断扩大，如2013年罗氏宣称拟投资8亿瑞郎用于全球生物药品的生产，2014年三星公司宣布以至少20亿美元的投资进军生物制药市场。 　　当今影响生物制药发展的重要技术之一是分离纯化技术。来自北京赛升药业股份有限公司的孔双泉在CISILE 2014&ldquo 药物纯化、检测技术专题论坛&rdquo 上分析了现有生物制药行业所用的分离纯化技术特点以及新兴纯化技术的发展。 　　从机理上划分，生物制药行业现行的分离纯化技术主要有五大类：基于溶解度差异的分离纯化技术、基于分子大小差异的分离纯化技术、基于选择性吸附差异的分离纯化技术、基于电荷不同的分离技术 、基于对配体亲和力差异的分离技术。 　　以基于溶解度差异的分离纯化技术为例，其主要包括盐溶盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点法、双水相萃取法和反胶团萃取法，每种方法均有其明显的特点或适合分离的对象。 方法 特点 盐溶盐析法 优点是温度系数小而溶解度大 有机溶剂沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化；低温一般先冷却&mdash 20度；常与其他沉淀方法联用。 等电点法 适用于低温操作．因对于许多生物分子等电点比较接近，故此法常与其他方法结合使用，较难扩大生产。 双水相萃取法 与传统的分离技术相比，具有操作条件温和、处理量大、易连续操作等优点。 反胶团萃取法 具有选择性高、萃取过程简单，正萃、反萃同时进行，能有效防止大分子失活、变性。其不足之处包括：普通离子型表面活性剂可能对产品产生污染；常用的离子型表面活性剂容易造成蛋白质的变性和失活。 　　从报告中获悉，现行的膜分离技术常用的膜有四种：用于细菌和病毒分离的微滤膜 用于蛋白质和多肽分离的超滤膜 用于抗生素、合成药物、核苷酸、无机盐分离的纳滤膜 用于无机盐分析的反渗透膜。 　　从纯化策略上看，生物制药的分离纯化主要分四个阶段：样品准备(破碎、过滤和离心)、粗提(分离、浓缩和稳定样品)、中度纯化(去除大部分杂质)和精细纯化(高纯度)。当前较为成熟的生物分离纯化技术如IEX、HIC等具有不同的特色。 层析技术 主要特色 粗提 中度纯化 精细纯化 IEX 高分辨率、高载量、快速 ★★★ ★★★ ★★★ HIC 分辨率好、载量一般、快速 ★★ ★★★ ★ AC 高分辨率、高载量、快速 ★★★ ★★★ ★★ GF 高分辨率 ★ ★★★ RPC 高分辨率 ★ ★★★ 　　分离纯化工业化影响因素主要来自设备和分离介质，目前生物制药企业纯化工业所使用的设备主要有GE AKTA Pure 蛋白质层析纯化系统、 高分辨率的分析制备平台&mdash &mdash BioLogic DuoFlow中高压层析系统以及北京创新通恒第三代工业化生产HPLC系统 分离介质主要有BIO&mdash RAD公司适合工业化的耐受高压层析介质-UNOsphere SUPrA 亲和介质和UNOsphere Q 阴离子交换介质、利用灌注层析技术制备层析介质-POROS胶体是灌注层析技术的填料以及PALL公司HEA和PPA HyperCelTM混合模式填料。 　　基于生物制药纯化对高通量、高分辨率等的追求，分离纯化技术也得到了快速发展，主要有三种：第一，扩张床吸附技术，该技术结合了澄清、浓缩及产品捕捉三个步骤，在基因工程产品的分离纯化过程中得到较好的发展 第二，径向膜层析技术，该技术由于流向的截面积大，具备了纯化速度快处理量大以及简单通过改变柱长便可增加上样量的特点，利于放大生产 第三，置换层析技术，与传统的洗脱层析技术相比，其明显的优势在于高上样量、高产率、高分辨率、易于操作等。 　　目前生物纯化技术的设备主要是以GE公司的AKTA系统，据了解，该产品在生物制药企业的全球市场占有率在90%左右，中国生物制药市场的占有量几近100%。相关消息显示，国内有研究机构和仪器制造企业已经着手生物纯化设备产品的研发，并已进入研发后期。在生物制药快速发展的今天，生物纯化设备也将得到快速的发展。(撰稿：杨改霞)