【分享】欧盟兽药检测方法（之二十七）

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2008/12/01

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气相色谱一质谱法确证测定肉、牛奶、蛋和尿中的氯霉素（EEC，确证法）
Chloramphenicol-Confirmation of Chloramphenicol in Meat, Milk, Eggs and Vrine by Gas Chromatography-Mass Spectrametry
（EEC Cy3.5 Confirming Method）

引言
氯霉素(CAP)是一种具有广谱性的抗生素，作为药物常用于家畜疾病治疗和预防。一些国家禁止在蛋鸡和奶牛上使用CAP。许多国家在肉制品中规定它的MRL为0－10 g/kg。
1. 应用范围
欧盟(EEC)对氯霉素制定了限制使用的规定。为了确保蛋鸡和乳牛饲养场不再使用氯霉素，为了对动物源肉品中氯霉素残留量进行监控，同时为了对饲养场和屠宰厂抽取的样品进行筛选即检测是否有这种药物残留，一旦经其它许多方法筛选呈阳性，必须用该法进一步检验确证。这项工作的贯彻完全符合欧盟有关的残留物指令(86/469/EEC)。
2. 应用范围
本法是用来确证测定肉、蛋和尿中氯霉素残留物，也适用于牛奶样品，本法检测限为0.1 g/L或0.1 g/kg。
3. 参考文献。
Commission Decision, 93/256/EEC, Laying down the methods for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action ［OJ. No L.118, 14.4. 93. pp 64-74］
2052/VI/84 File 6.11 II-4, Scientific Veterinary Committee, Working Group-“Reference Methods for Residues”, General Criteria for the establishment of Reference Methods for the Detection of Residues.
ISO standard 78/2-1982 Layout for standards-Part 2: Standard for Chemical Analysis.
Development and validction of a gas chromatographic spectrometric procedure for the quantitation and identification of residues of chloramphenical. Van Ginkel, L. A., Van Rossum, H.J. zoontjes P.W., Van Blitterswijk, H. Ellen, G., van Heeft, E., de Jong , A.P.J-M., and zomer, G.(1990), Anal, chim, Acta. 237., 61-69.
Eine Radioimmunlogische Bestimmung Von chloramphenicol-Riickstanden in Muskurlatur, Milch und Eiern. Aruold. D., Berg, D.Van, Biertz, A.K., Mallick, U and Somogyi， A (1984), Arch. Lebensmittelgyg. 35, 131-136.
Reference standards for residue analysis of chloramphenicol in meat and milk: A critical study. Balizs, G. and Aruold, D. (1989), Chromatographia, 27, 489-493.
Trace analysis of chloramphenicol residues in Eggs, Milk and Meat: Comparison of gas Chromatography and radioimmunoassay. Arnold, D. and Somogyi, A. (1985). J. A. O. A. C., 68 984-990
EEC Document: 2406/VI/85-EN File 6.21 II-4 “Draft Relerence Method for the detection of residues of chloramphenicol in meat”.
4. 定义
氯霉素含量是指按本法测得的被测物质中氯霉素的量，不考虑其化合物的形式。含量以mg/kg或 g/L表示。
5. 方法提要
本法包括六个步骤：
尿： (1) 尿样水解
(2) Extrelut柱提取
(3) Sep-pak C18小柱净化
肌肉和蛋： (1) 均质
(2) 萃取至乙酸乙酯中(EtAc)
(3) HPLC净化
(5) 衍生
(6) 色- 质联用(GC/MS)分析
注意：(6) 氯霉素可用质谱仪在(EI)或(ECNICI)模式分析，按照ECNICI测定，其检测录敏度可增加5－10倍。
牛奶样经适当脱脂后，可按尿样方法提取。
6. 材料
6.1 化学试剂
6.1.1 基准物质（标准样品）
标准化合物
氯霉素。Cas NO.56-75-7; C11H12Cl2N2O5, M = 323.1
(Boehringer- Mannheim, NL, Art No. 634433)
6.1.2 内标37Cl2-氦霉素，由RIVM合成
6.1.3 乙醇
6.1.4 甲醇
6.1.5 异辛烷
6.1.6 乙腈
6.1.7 二氯甲烷
6.1.8 盐酸
6.1.9 乙酸乙酯
6.1.10 醋酸
6.1.11 醋酸钠
6.1.12 硫酸钠
6.1.13 ExtrelutR (Merck, art. No. 11737填料art. no. 11738)
6.1.14 醋酸缓冲液，2.0mol/L, PHS.2
将25.2克醋酸(6.1.10) 溶解于600mL水中,加129.5克醋酸钠(6.1.11).调节pH至5.2±0.1, 最后定容至1000mL。
6.1.15 HPLC洗脱缓冲液，乙醇/异辛烷(3:97，V/V)。
6.1.16 磷酸二氢钠
6.1.17 磷酸二氢钾
6.1.18 固相萃取混合溶液
6.1.18.1 甲醇/水(10:90，V/V)，混合10mL甲醇和90mL水。
6.1.18.2 甲醇/水(45:55，V/V)，混合45mL甲醇和55 mL水。
6.1.18.3 乙腈/水(20:80，V/V)，混合20 mL乙晴和80mL水。
6.1.19 内标贮备液，含量1g/L于乙醇中，在－20℃下保存。
6.1.20 内标工作液，含量0.01g/L于乙醇中，在＋4℃中可保存2周，从贮备液中移取最小体积为0.1mL。
6.1.21 衍生试剂：N,O-613(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)与1%四甲基硅烷TMS (Pierce, art no 398832)。
6.1.22 －葡糖苷酶/硫酸酯酶 (Brunschwig Chemie, Amsterdarn, Nl).
6.1.23 固相萃取柱(Sep-Pak ,C18) (Waters-Millipore, art. No 51910)
6.1.24 固相萃取柱(Sep-Pak, Silica) (Wators-Millipore, art. No 51900)
7. 仪器设备
7.1 玻璃圆底烧瓶：150mL。
7.2 玻璃巴氏细移液管。
7.3 自动移液器。
7.4 冷冻离心机。
7.5 台式离心机。
7.6 玻璃离心管： (55mm×11.5mm)。
7.7 电热水浴锅，温可调至50±2°C和37°C±2°C并配有氮装置。
7.8 涡旋混合器。
7.9 HPLC系统。
7.9.1 标准恒流HPLC仪，用于萃取液净化。
7.9.1.1 HPLC泵，600Ａ型(Waters/Millipore)或相当者。
7.9.1.2 自动进样系统(Waters/Millipore) 或相当者。
7.9.1.3 固定波长UV检测器(254nm)，400型(Waters/Millipore) 或相当者。
7.9.1.4 顶柱Chromguard型(Chrompack 028185) 或相当者。
7.9.1.5 HPLC柱(150mm×4.6mm)内填Lichrosorb Diol微珠(Merck) 或相当者。
7.10 玻璃衍生瓶：具螺旋盖。
7.11 培养箱。
7.12 具有吹氮装置的专用加热器具(Pierce no. 19=8790)，用于对衍生瓶的加热。
7.13 玻璃进样瓶。
7.14 铝盖。
7.15 气－质联用仪，带EI电离源。
7.15.1 气相色谱仪。
7.15.2 自动进样器。
7.15.3 质量选择检测器(MSD) (HP 5970) 或相当者。
7.15.4 化学工作站(HP 59970)。
7.15.5 打印机。
7.15.6 气相色谱柱，SE-52石英毛细管柱，25m×0.25mm ID，膜厚0.25 m ( Machery-Nagel, art no. 723054)。
7.16 GC-MS装置，带化学电离(CI)源。
7.16.1 气相色谱仪（Finningan 9610型,San Jose,CA）或相当者。
7.16.2 质谱仪(Finnigan 4500型，四极质谱) 或相当者。
7.16.3 色谱柱，CP-Sil-19CB石英柱， (25m×4.4mm ID,膜厚0.25 m),(chrompack Middelburg, NL)。
7.17 旋转蒸发器，带40±2℃水浴。
7.18 粉碎机。
7.19 均质机。

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第1楼2008/12/01

8. 样品和取样程序
N.B. 在6.3.1节和ISO78.S-1982文件中列明注意事项。下面注释源于2052/VI/84-EN中附录Ⅱ和EFL93/256。
8.1 样品性状：样品应是64/433/EEC指令中定义的能用于肉样中残留物检测的样品，当肉样不能测到残留物，可用生物体液(本法用胆汁)或粪便作为残留物测定的样品。
8.2 样品量：样品量应满足进行复验和仲裁检验所需的样品量。采用本法一次性测定所需的量为：
肉10g，尿10mL，蛋10g，牛奶10mL。
8.3 样品及其包装在实验室内能得到清楚的鉴别。
8.4 样品的包装、保存和运输方法应保持其完整性，以免影响结果。
氯霉素的分析样品必须在温度低于－18℃贮藏和运输。
9. 检验步骤
9.1 尿样
9.1.1 水解
在10mL尿液中加入醋酸溶液(6.1.10)，调节pH至5.2。加入0.5mL2mol/L醋酸缓冲液(6.1.14)，及20uL葡萄糖苷酶(6.1.22)于20mL瓶中，在37℃中培养2小时。
按9.7步骤加入内标
9.1.2 Extrelut柱净化
按照制造商说明书制备Extrelut柱(6.1.13)
在冷却的尿/缓冲液中加入2mL水，将其并加入柱中，停留15分钟，使其吸附于柱上，用2×25ml醋酸乙酯将尿中的氯霉素萃取出。
在50℃，减压蒸去乙酸乙酯至干，通常可见少量残留物。加2ml甲醇将残留物溶解，移至含5ml水的玻璃管中，用甲醇清洗烧瓶二次，并入玻璃管中。在50℃水浴中，吹氮将甲醇/水混合液浓缩至4ml。
9.1.3 Sep-Pak C18柱净化
Sep-Pak小柱预先用2mL甲醇(6.1.4)和5mL水淋洗2次。加入提取液，用5mL水和5mL甲醇/水(10:90, V/V)(6.1.18.1)淋洗，氯霉素用5mL甲醇/水(45:55, V/V)(6.1.18.2)洗脱。在50℃吹氮下将洗脱液浓缩至干，待HPLC净化。
9.2 牛奶
经适当脱脂后，可按尿方法处理。
9.3 肌肉和蛋
9.3.1 提取
将200g肌肉或蛋在均质仪(7.18)中均质。精确称取10g均化后的样品至250ml离心管(7.6)中，加入100mL乙酸乙酯(6.1.9)和30克硫酸钠(6.1.12)。将混合物在均质器(2.19)中均质1分钟。于1800 g离心，30min。取75mL上清液于150mL圆底烧瓶(7.1)。在50℃中减压蒸去溶剂。按9.7步骤加入内标。
9.3.2 Sep-Pak柱净化
Sep-Pak硅胶小柱(6.1.24)先经5mL乙腈/水(20:80, V/V)(6.1.18.3)和5mL二氯甲烷(6.1.7)淋洗。小柱用氮气充满将提取物用5mL二氯甲烷(6.1.7)溶解，移入小柱。用2×5mL二氯甲烷淋洗容器后并入小柱中。用氮气吹小柱至二氯甲烷全部排出。
用5mL乙腈/水(20:80, V/V)洗脱氯霉素三次。用1mL乙酸乙酯抽提洗脱液，提取液合并后用1mL水洗涤，在50℃中吹氮蒸发至干，待HPLC净化。
9.4 HPLC 净化
吹干的残留物用0.3mLHPLC流动相(6.1.15)溶解，取0.25mL注入HPLC仪器中。收集氯霉素出峰前后0.5min的馏分。收集的馏分在50℃水浴中吹氮气蒸发至干，待衍生化。
9.5 衍生化
将吹干的提取物(9.4)用无水乙醇溶解,并移入衍生瓶(7.10)中。加入0.1mL BSTFA/1%TMCS(6.1.21)，在60℃衍生1小时。在50℃吹氮蒸去溶剂，残留物用25ul异辛烷溶解。
同时进行氯霉素标准的衍生化。
9.6 GC/MS分析(CI)
对于氯霉素残留物的定量和鉴定，可采用负离子化学电离(ECNICI)或电子轰击电离(EI)方式。
9.6.1 GC-ECNICI(MS)
GC’MS系统：CP-Sil-19CB石英毛细管柱，载气，He，柱头压，1.1×105Pa；延迟时间0.05秒无分流进样；进样口温度260℃；柱温，起始柱温为150℃，进样后1分钟内升至270℃；GC和分离室温度分别为260℃和270℃，离子源温度为140℃；灯丝电200uA；甲烷为反应气；离子源压力50Pa；最佳电离能量70－90eV；停留时间0.052秒。分析以选择离子监测（SIM）模式，（在m/Z=276, 466, 468, 470(内标)）记录下列离子的丰度。
9.6.2 GC-EI(MS)
7.16中GC-MS系统采用了SE-S2石英毛细管柱；载气氦气；柱头压1×105Pa；停留时间0.05s。分析以SIM模式进行，（在m/2=225, 242, 361和451）记录下列离子的丰度：
9.7 标准添加程序(定量和回收率)
9.7.1 在10g或10mL均化后的样品中添加0.1mL内标(6.1.2)液，加入氯霉素的量相当于样品中预计最高浓度的一半。测试样品完全混合后，在室温下放置30min或在4℃下过夜。
10. 结果计算
如果GC-MS数据符合下面标准(参见手册第5部分)，则确定样品中含有氯霉素。
1. 保留时间与标准品一致。
2. 在扣除背景后所选择的离子在所选峰的质谱图中均出现。
3. GC-ECNICI(MS) 所选择的离子比与标准品一致，评判标准为：A486/466( 1)在理论值0.76的10%之内，A378/376( 2)在理论值0.70的10%之内。A376/A466( 3)在相关标准品的10%之内。
4. GC-EI(MS) 所选择的离子比与标准品相一致。评判标准为：A242/225( 1)，A361/225( 2) 和A451/A225( 3)在相关标准品的10%之内。
标准品和样品的实验条件应相当。
如果氯霉素在样品中存在，且满足上述评判标准则可定量计算：
对于(ECNICICMS)：计算A466/AC470值。其中Ac470是A470的校正值：
Ac470=A470-0.184A466。
由于离子M/z466的氯同位素峰在M/z470有响应因此必需加以校正)。浓度在0－20u g/kg或ug/L范围内呈良好线性。( ＝0.9992，截距经过原点)
对于EI(MS)定量，可按相同过程进行。
检测限：尿样或牛奶0.1ug/L,肌肉或蛋0.1ug/kg。
10.1 精密度
在RIVM 的三个实验室分别对尿样进行重复性和再现性试验，每组平行测定5次。
(GC-MS方法)，结果为：
浓度实验室内实验室间
ug/l CV CV
2.83 8.0% 9.7%
12.0 2.3% 9.9%
11. 特殊事例
12. 步骤注解
13. 质量控制标准品和标准参考物质
对于肉、牛奶和蛋(见参考手册第8节)的标准参考物质可通过BCR程序得到内标为：37Cl2－氯霉素
注意：BGA用D5-氯霉素作内标。
14 检测报告：
除了说明样品的定性鉴定，选用的方法，定量的结果或预计的组份的存在形式外，还要说明测定过程中的特别现象，任何方法没有说明的操作或任何认为可能影响结果的情况。
15. 缩略语
重要缩略语见有12节附录1。
16. 检测流程图
尿样 Extrelut柱吹干水/甲醇 SEP-PAK C18小柱水/甲醇 HPLC 或
肌肉、蛋吹干 SEP-PAK硅胶柱
萃取至乙酸乙酯层经HPLC净化用BSTFA/TMCS衍生-TMS衍生物的GCMS测定计算结果