【分享】欧盟兽药检测方法（之二十三）

注意：
(1) 所有组织样品在分析前应冷冻保存。
(2) 一般清洗方法不能彻底洗取离心管的残留物，最好在清洗前所有玻璃器皿浸泡在清洗液中煮沸2小时。

（a）称取5.0 ± 0.1g匀浆的牛肝和牛肉于50 mL聚丙烯离心管中。
（b）分别在待测样和控制样中加入50 μL玉米赤霉醇内标（0.2μg/μL）和50 μL(已烯雌酚内标0.1 ng/mL)(相当于2.0和1.0 ppb)。
（c）用移液管加11 mL 0.04 M醋酸钠缓冲液。
（d）匀浆1 min。
（e）滴加冰醋酸缓冲液调节pH至4.25 - 4.75（边滴边混合并检测pH值，通常5 - 8滴）。
（f）按下表添加玉米赤霉醇（0.2 ng/μL）和DES-MC (0.1 ng/μL),进行标准品线性回归分析。
-------------------------------------------
浓度(ppb) 添加体积
DES 玉米赤霉醇 ( L)
-------------------------------------------
0.00 0.00 0.0
0.50 1.00 25.0
1.00 2.00 50.0
2.00 4.00 100.0
-------------------------------------------
如果DES为0.25 - 0.5 ppb间,添加标准品浓度低一个数量级。
（g）加100 μL –葡糖苷酶至各样品管中(10,000U)。拧紧盖子,快速混匀10秒。
（h）37oC中恒温或水浴16-18小时或过夜。
(i) 恒温结束后,加16.0 mL乙腈于各样品管中,用手或震荡器中摇动5分钟。
（j）在2450g离心5分钟。
注:离心力(g)=1.118 10-5 r (rpm)2
r = 旋转半径,指轴心到管底的距离(cm)
rpm = 每分钟转数
（k）上清液转移至50 mL具螺口盖的离心管中。
注意:转移上清液时有少许悬浮物带入,不影响测定。
（l） 加2mL二氯甲烷和8mL正已烷至上清液中。
（m） 用手或震荡器摇动1分钟。
（n）在1060g离心2分钟。
（o）用10mL一次性吸管吸取中间液层(乙腈)至干净20mL闪烁瓶中,不要带入其他液层。
（p）加4mL乙腈到剩下的两相的离心管中。
（q）手工摇动1分钟。
（r）在1060g离心2分钟。
（s）按步骤(o)操作,被吸液加入至同一闪烁瓶中。
停止点：此时样品在室温条件下仅可保存1小时。
（t）用Fisher 190 型浓缩器可在60℃条件下，用过滤的空气流或压缩空气将合并的乙腈液缓慢挥发至干或用常规加热器用氮气流在60℃慢慢吹干。
注：必须除去所有乙腈，约需要45-60分钟。
（u）加入2mL异丙醇-甲醇(1:1),快速震荡5分钟使残余物溶解
（v）加入1.5mL 2N氢氧化钠,震荡5-10秒钟。
注意：此时要进行柱净化。
（w）取AS型离子交换小柱,倾去离子床上液体。
（x）将步骤(v)的样液加到柱床中,用1.0mL异丙醇-甲醇润洗样品瓶,一并加入。将小柱嵌在旋转器内侧环中,塑料废液杯和样品回收杯放在旋转器的外侧。
（y）盖上Prep I盖子,选择程序7。用STEP ADVANCE 开关预制过程STEP 2, 按STEP ACTIVATE/HOLD 开关,使仪器开始运行.4分钟后再按 STEP ACTIVATE/HOLD 开关结束运行。打开盖子,将废液杯倒空，放回原处。
（z）在各小柱中加4mL甲醇,重复步骤(y)
aa. 向溶剂槽1,2,3,4中分别加入下面的溶剂:
洗涤剂1: 溶剂槽1中加入18mL蒸馏水,相当于每小柱加1.4mL。
洗涤剂2: 溶剂槽2中加入33mL 5%醋酸,相当于每小柱加2.75mL。
洗涤剂3: 溶剂槽3中加入22mL 25%甲醇,相当于每小柱加1.75mL。
洗脱剂: 溶剂槽4中加入33±3mL甲醇,相当于每小柱加2.75±0.25mL。
注意:甲醇洗脱液体积需要进行调节(±3mL),这样在步骤(cc)最终体积<0.5mL。这一体积可以根据自己实验室和Prep I仪由化验师预先设定。
bb.选择程序7,用STEP ADVANCE开关预置STEP 3。设定挥发温度至55oC(约为设定5),用START开关启动程序。
cc.程序结束后,取下塑料回收杯,用巴氏移液管将甲醇洗脱液(0.1 - 0.5mL)转入到1mL自动进样器的样品瓶中。如果样液超过0.5mL，在预热的电热板上挥发浓缩。用移液管在回收杯中加200μL甲醇润洗，移入至上面样品瓶中，60oC中氮气流下挥发近干，待GC/MS分析。
注：提取液需保存在0℃及0℃以下，不超过2天。
5.051E. GC-MS分析
a. 在测定玉米赤霉醇时，为获得高灵敏度和对待测峰特别是玉米赤霉醇分离度，仪器测定条件需最佳化。下面列出一种可能的最佳化条件。
GC 惠普5890
色谱柱 HP专用12m 0.2mm i.d., 0.33μm交联，100%甲基硅烷.
（16m 0.20mm i.d., 0.5μm柱已在使用）.
进样器 无分流进样，最低260oC
载气 氦气，30cm/s
源温度 250oC
接口温度 260oC
20oC/min 5oC/min
程序温度 130oC，1min ----------→ 230oC ----------→ 295OC
(如果终了温度是低于285OC的，那么在两次进样间要有足够时间使干组
分全部流出)
MS HP5970A-MSD
离子化模式 电子轰击型
电子能量 70eV
MSD自动校正
在上述条件下各组分的保留时间为：
cis DES 7.3
trans DES 8.0
玉米赤霉醇内标 10.3
左环玉米赤霉醇 12.8
组分 离子（停留时间=100 ms）
玉米赤霉醇内标 435
玉米赤霉醇 538，523，433，379
D8-DES 420
DES 412，397，383
b. 用10 L乙酸乙酯溶解残渣，加BSTFAHE和2%TMSI采用柱上衍生技术对样品进行衍生化。用注射器吸取2.0μL样液，再吸取等体积的衍生化试剂（针头在插入衍生化试剂之前，用浸有乙酸乙酯的擦镜纸擦干针头）。采用无分流进样，将注射器中全部内容物（4μL）注入进样口中。
5. 051F 计算
a. 从积分报告中读取所选离子的峰面积和峰高
b. 按下面计算离子比：
玉米赤霉醇：523/538；433/538；379/538
DES：397/412；383/412；对于cis和tran DES峰