【分享】欧盟兽药检测方法（之二十五）

7、设备
涉及公司和/或产品仅供参考，同类型的其它产品也适用。
7.1 液闪计数器：带自动换样器
7.2 闪烁瓶
7.3 冷藏间
7.4 冷冻/致冷室
7.5 –20℃深度冷冻装置
7.6 通风橱
7.7 离心机
7.8 低温离心机，可用于大量小试管
7.9 台式离心机
7.10加热设备
7.11 37℃水浴/恒温箱
7.12 40°/45°水浴箱
7.13 电磁搅拌器
7.14 玻璃器皿
7.15玻璃试管75mm×12mm
7.16 带塞的玻璃试管125mm×16mm
7.17 多用玻璃瓶，约25mL，带塑料螺帽
7.18 旋涡混匀器
7.19 吸管和自动加液器
7.20带有一次性吸液尖的半自动微量吸管
7.21 巴斯德吸管
7.22 量杯（tilt measures）（5mL,乙醚用）
7.23 自动加液器：用于液闪剂。
7.24 用于溶液蒸发的适当设备，如压缩氮气源和蒸发管或旋转蒸发器。
注：在使用氮气流或旋转蒸发器皿时，应在不超过50℃下蒸发溶剂。
8、样品和抽样程序
本节注意事项是依据6.3.1和ISO文件（78/2-1998〕起草的。下列注意事项源于2052/V1/84-EN的附录II。
8.1样品的性状：样品应达到64/433/EEC指令规定的肉中残留检测有关要求。
8.2样品量：样品必须足以满足进行本方法测定，并足以进行所需要的重复分析。
8.3 抽取和包装方法必须适合在实验室予以鉴别。
8.4 包装、保存和传递方式必须保证样品的完整性，且不得影响实检结果。分析己烯雌酚的样品必须-18℃以下贮存和传递。
9、步骤
9.1.1 各加O.5mL空白尿液到4个试管(7.16)或多用瓶中(7.17)。
9.1.2 各加0.5mL空白尿液和100pg 己烯雌酚至4个试管(7.16)或多用瓶（7.17)中做回收率。
9.1.3 各加0.5mL空白尿液和90pg 己烯雌酚于4个试管(7.16)或多用瓶(7.17)中作质量控制(QC)检查。
9.1.4 加0.2mL尿样到试管或多用瓶中(做双试验),通常仪器可应用30份样品。
9.2加50μL酶(6.3.4)于9.1.1—9.1.4各试管/通用瓶中，37℃保温2小时。
9.3 令其冷却,加5mL乙醚(6.1.3)，旋涡混匀15秒。
9.4 在200rpm下离心5min。
9.5 于干冰/丙酮浴中冷冻样品，将乙醚相倾入玻璃试管(7.15)。
9.6 在氮气流下蒸发至干(7.24)。
9.7 放射免疫分析
本方法用活性炭将结合的抗体和游离的配体分离。
9.7.1 分别吸取0.1mL甲醇到7个RIA试管中(7.15)，（其中3管用于非特异性结合（N.S.B.），4个试管作为0标准管)。将含有5-500pg的己烯雌酚标准溶液(6.3.2)各取0.1mL，加入R1A试管中。(一式三份)在氮气流下蒸发至干(7.24)。
9.7.2.1 加60μL甲醇至所有试管中。(9.7.1 9.6)加640μL明胶—磷酸盐缓冲液(6.3.4)至3个非特异结合试管中，及540μL缓冲液至其余试管中。
9.7.2.2 加0.1mL3H—己烯雌酚(6.3.7)于所有试管中和2个闪烁瓶中(用于总计数)。
9.7.2.3 除3个用于做非特异结合的0标准管外，所有试管中均加入0.1mL抗体(6.3.8)，3个NSB管加0.1mL缓冲液(6.3.4)。
9.7.3 旋涡混匀几秒
9.7.4 置全部试管37℃水浴15min，而后4℃保温过夜
9.7.5. 4℃下加0.5mL活性炭悬浮液(6.3.5)
9.7.6 用手轻轻振摇全部试管约1min，4℃下静置10min
9.7.7 4℃下，于2000—3000 rpm离心20min
9.7.8 将上清液倾入闪烁瓶中(7.2)
9.7.9 所有瓶中均加入10mL闪烁剂（6.5.2），其中2个瓶装有0.1mL氚标记己烯雌酚溶液(9.7.2.2)和2个瓶装有0.1mL明胶—磷酸盐缓冲液(背景计数)。
9.7.10 将样品置于液闪计数器(7.1)并计数(预置时间和计数)，如10000次计数或10min。
10、结果计算
10.1 将含有0-500pg标准各瓶中与抗体结合的氚标记己烯雌酚的cpm，对应标准pg数作图，制定标准曲线。
10.2 根据测试样品和空白试剂的cpm，从校正曲线上读出己烯雌酚的pg值。
10.4 样品中己烯雌酚浓度的计算
己烯雌酚pg=(标准曲线pg值-空白pg值)×5×回收率校正系数
标准曲线pg值=由10.2步得到的pg值
空白pg值=由10.2步得到溶剂空白pg值
回收率校正系数由含100pg试管(9.1.2)的回收率测得。
10.5 替代的计算
B=结合抗体的cpm-非特异性结合（NSB管9.7.2.3）cpm
B=0标准管中结合抗体的cpm-非特异性结合的cpm
B0应在总计数（cpm3H-DES（SA））的40-60%之间
将B/Bo对应标准pg值作图绘制标准曲线。
如果计算机程序系统可能的话,那么,最好以标准的对数值,对应LnZ/(1-Z)作图,其中Z=B/Bo(LOGIT图)能用于插入结果。应用cpm-NSB计算试样和溶剂空白的B/Bo值，从校正曲线上算出己烯雌酚 pg值。按10.3 进行处理。
最后结果中应包括原始计数数据。
10.6添加空白尿液的回收率和精密度数据
浓度(ng/mL) 回收率（%） 实验室内相对标准偏差（CV％）
0.5 85 15
5 90 12
10 92 8
数据来源于肉类控制实验室Dublin,1reland
11、特殊情况 略
12、操作注意事项
——如果RIA试管未经硅烷化处理则可得到更好的结果
——在RIA试管中加入甲醇有助于己烯雌酚重新构成溶液
13、抗体
己烯雌酚抗体可以通过商业渠道购得，但建议从共同体基准实验室获得最新的有关信息。
14、质量控制 略
参看手册中第8节以获得己烯雌酚RMS细节
15、缩写表
NSB:非特异性结合率；SA，标准附加；完整的缩写表在附录中I12节给出。
16、检验流程图
尿→水解
↓
计算结果←RIA←乙醚提取