【第二届网络原创作品赛】一次液相色谱方法的探索

梯度洗脱系统分类
依据格拉基和柯克兰对不同的洗脱系统进行了分类，如图：

简单等强度洗脱就是等度洗脱方式，反相色谱中H2O作为流动相主题，MeOH、CH3CN、THF作为改性剂。
可用图表示：

四种溶剂的比例均固定不变，在三角形中任意点表示四种溶剂任意固定比例。
等强度多溶剂程序洗脱，是在保持溶剂强度在分离过程中保持不变，在运行过程中借助流动相组成的连续或分布变化，使分离选择性获得改善。
用图表示为：

在保持整体溶剂强度不变的前提下，借助改变溶剂流动相的组成比例来实现。在图中的1、2、3均为等度洗脱，混合物分离达不到要求，当色谱分离采用由1向2洗脱，成分分离较好。
等选择性多溶剂梯度洗脱是目前运用的最多的洗脱方式，其图示为：

从图中可以看出，流动相H2O的比例减小，有机相比例增加，使得溶剂的强度发生改变。在梯度洗脱分离时为了保持恒定的选择性，溶剂强度以线性方式在连续减小。此情况表明使用四元溶剂组成的流动相进行优化，可以分离容量因子差别很大，对所有成分都具有很好的分离度。
选择性多溶剂梯度洗脱，指在色谱运行过程中，溶剂强度、选择性和组分都在改变。图示为：

在梯度洗脱过程中，刚开始溶剂梯度时，流动相的溶剂强度低，保留性强的组分在色谱柱中无明显的移动，此时对分离低保留性的组分较好，随着溶剂强度的连续或分步增加，保留性强的组分也逐渐被洗脱出来，选择性不断改变，最终使具有不同保留性的组分获得良好的分离。

好了，现在开始介绍下一次梯度的摸索。
现在需要做的工作是：
1、了解该味药的研究概况，包括化学成分，含测测定等。
2、了解该药在此方面的研究情况。
3、了解同类药在此方面的研究情况。
4、了解此方面的相关知识。
由于该药目前在这方面还尚属空白，所以可行性较高。通过查阅和熟悉相关文献的报道，结合该味药的具体情况，设计实验。
一、线性洗脱，看成分的分布情况
选择文献相关报道，采用甲醇-水，甲醇-酸水线性洗脱60min，得到相关图谱：

甲醇-水的线性洗脱图谱

甲醇-酸水的线性洗脱图谱

比较以上图谱，甲醇-水出峰时间很长，且前面的峰较小较少，在一个小时达不到完全分离，酸水线性洗脱分离度较差，但是整体出峰时间较合理，故确定酸水为流动相。

二、优化梯度，得到一个初步较为合理的图谱
参考文献报道及初步调整得到各色谱图：




为什么要先初步定下一个梯度，是为了方便对样品的处理方式进行考察。
通过几次摸索和优化对比，初步确定最后一张图谱的色谱条件为初步梯度条件。

三、不同处理方式的考察
通过不同的有机溶剂提取，不同提取方式和提前时间的考察，在最初步的条件下得到各色谱图。

一溶剂提取得到的色谱图


另一种溶剂的提取效果（在相同的梯度条件下）


一溶剂的提取效果

由于不同溶剂的提前后组分对梯度表的敏感性比较强，所以有时在初始梯度下得到的图谱并不理想，需要在做的时候，不断的优化。

四、流动相的种类考察
选用不同的溶剂（包括不同强度有机溶剂的选择、离子对试剂的使用，缓冲体系的使用等等。）
以下节选几个色谱图：
不同强度的有机溶剂的影响：





继而考察不同流动相酸碱环境的影响：
得到不同的图谱：
以下随着酸值的减小变化趋势图。从以下图谱对比，选择酸度为第一个图所对应的酸碱度。

五、因素全部确定后最终优化
通过以上对不同提取方式、不同强度的溶剂、不同的酸碱环境的考察，最终确立条件。根据此确立的条件最终优化图谱，此时需要注意的是对图谱的全貌进行观察。在优化梯度的时候，可以分段优化，如可以选中对一组峰进行分离，其他梯度保持不变，在优化完全之后，再选择另一组峰进行分离。当然影响分离度的因素很多，如上面的几个因素，在确定以上因素后，可以通过添加剂或比例的变化来改善分离度。

六、此条件下的梯度曲线
通过对本次梯度的摸索，采用等选择性多溶剂梯度洗脱，其梯度洗脱曲线大致可以描述为：

对于上述梯度曲线的采用的还是使用非常普遍的等选择性多溶剂梯度洗脱，即在弱洗脱溶剂不断减少的同时，强洗脱溶剂不断增加。
梯度曲线的走势是由样品中的成分以及采用的流动相有关。样品经过前处理提取纯化为某一类物质的话，可以用等度或者梯度变化非常缓慢。如果样品成分复杂，尤其是对于复方类成分，前处理过程较简单，此时样品极性差异较大，梯度变化也非常的剧烈。此时往往表现的是基线的飘移，有时还会带有鬼峰的出现。如果不是做指纹图谱，可以把前处理条件选择的较为复杂点，以给分析样品带来方便。
至于我的这个梯度曲线，样品成分极性差异较大，而且成分含量差别也非常的大。成分含量高，峰面积大，往往把含量低的成分给掩盖掉。图片在18min以前样品极性较大，含量较低，所以大家看到图谱别以为18min以前没有峰。如果没有峰的话，初始梯度比例就会设的大些。主要成分在20min左右。在分离到55min左右，样品极性非常小，曾经摸索过，需要至少80%的有机相才会出峰，而且梯度升到100%有机相，再走5min左右所有物质全部出峰（根据保留时间的考察确定）。所以，样品成分是：非极性成分较多，极性成分也稍多，中间极性较多。采取的是小梯度变化非极性成分，长时间洗脱中极性成分，维持数分钟极性成分。绘制的梯度曲线如上图所示。

七、总结
对于梯度的摸索是一个比较繁琐的一个过程，所以一定要细致耐心，往往在你“走投无路”的时候就会“柳暗花明又一村”的，关键是多练习，多积累，理论结合实际。当然自己需要学习的东西也很多，有不足之处还请见谅！

很清晰，图文并貌很好，多谢！

有个缺点，理论性东西过多
自己的经验太少，应该多加分析实际例子加以改善比较效果