【资料】细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题

含有的内毒素就会被其它没有污染瓶样品所稀释，并低于MVD，从而检测不到污染的样品。因此，采用合并样品进行试验时，MVD应降低，这种情况下的MVD等于原来的MVD除以合并样品的数量。
例如：假定鲎试剂的标示灵敏度λ为0.125EU/ml，样品的MVD为100（倍）。


预试验结果表明样品在1：8倍稀释时，具有抑制作用，不干扰浓度（NIC）为1:16，可选择用于验证试验的稀释度或浓度为最低不小于1:32，可以选择1:64。
4、方法学验证试验（增强/抑制试验）
验证试验在细菌内毒素方法学的建立过程中具有十分重要的作用，主要目的是确证检测内毒素的方法是否受样品的干扰。验证试验的特点是样品浓度保持不变，添加内毒素的浓度逐渐降低。在建立细菌内毒素检查方法中，验证试验前，要去除样品可能含有的内毒素，以确保建立方法的准确可靠。凝胶法的验证试验是通过在细菌内毒素检查用水和样品溶液中平行进行鲎试剂标示灵敏度的复核试验完成，试验中要求样品平行4管，设立样品阴性对照管，也同样平行4管。尽管要求添加内毒素标准平行管数量各国不完全一致，可以2管，也可以4管，但鉴于目前国内的具体情况，在2005年版药典附录的细菌内毒素检查法中规定是平行4管。细菌内毒素检查用水和样品溶液中的反应终点浓度的对数平均值（内毒素含量）必须在鲎试剂标示灵敏度的2倍范围以内，在样品溶液和细菌内毒素检查用水中的反应终点浓度的对数平均值也应相互在2倍范围之内（2λ~0.5λ）。光度法的验证试验中，要求阴性对照所含有的内毒素必须明显低于标准内毒素曲线中的最小浓度，阳性对照的内毒素回收率，在扣除样品可能含有的内源性内毒素后，必须在已知添加内毒素量的50%～200%之间，添加和未添加内毒素的样品管数量至少要平行2管。
二、细菌内毒素检查方法建立时注意事项及常见问题
1、在方法建立的过程中，对方法的验证非常重要
一个全面可靠的细菌内毒素检查法的方法学验证试验一般应注意：首先要了解产品的溶解度，按照适当的临床用量确定合适的内毒素限值，并确证产品对方法是否存在干扰，如果在样品处理过程中运用了激烈的处理条件或溶剂，还应证明所采用方法不会破坏或减少样品中细菌内毒素含量。其次应考察样品批与批之间的差异是否会引起方法学变异。此外，还应注意实验中涉及到的试验器材对方法学的影响，如：器皿的控制、鲎试剂标示灵敏度（或光度法检测用鲎试剂的检测限）等。最后，要确保仪器的运行状态和对实验过程的准确记录。总之，只有验证了整个实验的每一个环节，才能保证方法学的可靠和成功。方法学验证终究是为药品生产质量服务的，验证本身也是一个动态的过程，是随着生产工艺、环境和检验条件改变而变化的。方法学验证实验记录，要抓住要点，将试验关键步骤记录详细，避免验证资料照抄药典附录，罗列一大堆规定，最终没有明确的方法及可操作性。
2、内毒素限值的确定十分关键
在细菌内毒素检查方法的建立中，计算内毒素限值L、MVD和MVC时，需要注意最大人用剂量、产品规格、鲎试剂的灵敏度等重要的参数，因为计算错误会导致后续的所有努力均告失败。常见的问题有：（1）临床用药剂量确定不正确，仅用常规用药剂量，未考虑临床可能的人体最大用药剂量和给药途径，在限值计算公式L=K/M中，由于对K值及M值的定义模糊，使K值及M值赋值不准确，最终导致限值计算错误。例如，某注射剂临床成人每次静脉滴注给药40～80mg，婴儿（三个月以上）静脉滴注给药每次10～20mg。按成人（体重60kg）剂量计算限值为3.75EU/mg，而婴儿体重仅为5kg左右，计算限值约为1.25EU/mg，如果不考虑临床每公斤体重最大用药剂量，细菌内毒素限值就会出现较大的差别。（2）有的申报品种细菌内毒素限值不是根据临床用量计算出来，而是根据同品种热原检查的剂量推算出来的，造成限值错误。（3）有的品种细菌内毒素限值从国外药典抄来，没有考虑该品种国内上市的临床使用剂量及中国人与国外人均体重等的差异，也造成限值确定不正确。（4）错误的计算日给药剂量（一日内多次给药）。（5）在品种规格（浓度）发生变化时，计算MVD没有进行调整。（6）建立方法时所用的最大给药剂量已经超出了临床所用剂量等。
3、在进行干扰试验预试验时不干扰浓度的确定方法不正确
对预试验的目的不理解，直接选用一个灵敏度的鲎试剂对应的MVD或MVC进行试验，如无干扰则以该浓度为不干扰浓度，有的甚至直接选用高灵敏度的鲎试剂对应的浓度作为不干扰浓度，未找到真正的不干扰浓度，使干扰试验失去意义。也有的申报单位仅选择1～2个样品浓度进行试验，同样使试验缺乏完整性。
4、供试品阳性溶液配制浓度（方法）不对
在使用简便方法配制供试品阳性溶液时，应将供试品溶液与细菌内毒素标准品溶液等量混合、稀释。如：配制含4倍稀释供试品溶液的细菌内毒素标准品溶液，应使用2倍稀释供试品溶液和4λ细菌内毒素标准品溶液等量混合、稀释。常见有的配制过程中直接使用4倍稀释供试品溶液或2λ细菌内毒素标准品溶液浓度等量混合，造成配制的供试品阳性溶液中细菌内毒素标准品或供试品浓度低一倍。
5、仅使用一个厂家的鲎试剂或一个批号的样品进行干扰试验，没有足够的代表性
2005年版药典明确规定细菌内毒素检查进行干扰试验时，应同时使用两个以上厂家生产的鲎试剂对至少三个批号的样品进行试验，但有的申报单位仅用一个厂家的鲎试剂或仅对一个批号的样品进行试验。因为大部分注册药品其生产工艺、所使用的敷料等均不是很稳定，不同厂家生产的鲎试剂其抗干扰能力也不尽相同，因此仅用一个厂家的鲎试剂或仅对一个批号的样品进行干扰试验，没有足够的代表性，确定的不干扰浓度可能在后续的试验中不准确。
6、错误认为一定要按最大有效稀释倍数（MVD）或最小有效浓度（MVC）进行试验
实际上，有的样品浓度很高也不干扰鲎试剂与内毒素的凝集反应，这种情况下，只要样品内毒素含量合格，可以在MVD范围之内，即小于MVD的倍数下进行试验。又如对样品进行检查时，也可以先用原液（预试验时原液无干扰）进行试验，如果内毒素检查也能合格，则不必进行稀释，这样做的直接好处是可以节约成本和时间，减少污染环节。如果一个样品在小于MVD的情况下试验时样品阳性管有干扰，或样品管为阳性，则可按MVD进行相对应的稀释后重新试验。如：某注射液，说明书中临床静脉给药最大剂量为7mg/h，制剂规格为10mg/ml，计算内毒素限值为420EU/ml，所采用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，计算MVD＝1680倍。显然内毒素限值确定不正确（人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h ），已超过了人体对细菌内毒素的最大耐受量；另外选择最大有效稀释倍数的稀释液进行试验，每次实验时要对样品进行1680倍的稀释，会使实验变得繁琐，不利于操作。
7、应严格执行中国药典2005年版细菌内毒素检查的有关规定
药典规定：（1）当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项品种建立内毒素检查法时，需进行干扰试验；（2）当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。这就要求在提供的申报资料中应提供相关的方法学验证资料，以证明方法的可行性及有无干扰的存在。只有严格按照有关要求进行了干扰试验，并证明该条件下无干扰，才能建立新的检查方法。有些错误的认为国内或国外已有生产的品种，方法学验证就可以不做，以至有些新药、仿制药未进行系统的干扰试验。

感谢楼主，辛苦了。

楼主说得非常详细
不知道楼主对化药在稳定性考察期间的细菌内毒项目变化有没有关注过，比如个别品种会不会在稳定性考察期间出现干扰？

总结的不错，现在很多药品都没有建立细菌内毒素检查方法。

很好的资料，学习一下。

好资料，和我们实际生产有关系，下载，给QA人员学习去。

感谢楼主分享，学习中

我们就是按最大有效稀释倍数（MVD）或最小有效浓度（MVC）进行试验


看楼主的帖子，回去好好研究下

2005年版药典明确规定细菌内毒素检查进行干扰试验时，应同时使用两个以上厂家生产的鲎试剂对至少三个批号的样品进行试验？？？
没有见到这样的明确规定