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【第二届网络原创大赛】浅谈代谢组学研究平台的建立

  • 小猪飞飞
    2009/09/15
  • 私聊

液质联用(LCMS)

  • 浅谈代谢组学研究平台建立
    代谢组学是继基因组学、蛋白质组学之后发展起来的又一热门学科,其特点是用系统生物学的角度去观察研究对象,藉此能找出有意义的生物学标志物或者鉴定出某些未知的成分。在这篇文章里,我首先介绍了代谢组学分析的整个流程,这个比较简单,主要涉及仪器软件方面。然后介绍了某种疾病的代谢组学研究的应用,目的是要寻找有意义的生物学比较物。这篇文章介绍了一个未知物的发现过程。虽然最后通过定性发现这个未知物不是具有临床意义的生物标记物,但我通过这个流程熟悉了代谢组学的概貌,在整个实验中运用了统计学的知识,也应用了各种定性手段。
    代谢组学同其他学科一样,不是一个独立的学科,它需要运用到各种学科的知识与技能。比如说后期的数据处理,以及定性时需要运用的各种手段。因此,代谢组学涵盖的内容相当广泛,在我这个初步的研究中也只是涉及到其中的某些内容,还有很多内容做的不是很深入或者没有涉及到。因此,这篇文章就算是抛个砖,目的是给新手们一个形象的认识(注意实验的层次性),也希望一些喜欢潜伏的高手们出来指导指导,提出您宝贵的建议,分享研究中的心得体会!
    这篇文章注重的是代谢组学方法学和思路,本实验报道的是阴性结果,也没有涉及到具体的疾病(文章中用某病代替,请给位版友谅解)。
    一 农药高暴露组与农药低暴露组
    a)目的:通过代谢组学的方法来区分某病男性和非某病男性的尿液,寻找有意义的生物标志物。
    b)研究对象:5位健康男性(农药暴露低)和5位某病男性(农药暴露高)。
    c)研究方法:
    i.前处理:1ml尿液经15000转/min离心;取上清液经0.2μm的水相膜过滤
    ii.仪器:waters UPLC-Q-TOF
    iii.数据处理:PCA
    d)图示:








    二 某病患者尿液代谢组学的研究
    1.小样本分析:
    a)目的:通过代谢组学的方法来区分某病病人和健康对照的尿液,以此建立人群中某病的非伤害性、灵敏度高、价格低廉的筛查方法,并寻找鉴定某病的特异性生物标志物。
    b)研究对象:8位某病患者的尿液; 8位非某病患者的尿液。
    c)研究方法:
    i.前处理:1ml尿液经15000转/min离心;取上清液经0.2μm的水相膜过滤
    ii.UPLC

    iii.Q-TOF ES+

    d)MS SCAN图


    e)Markerlynx数据分析
    初步分析,发现614.7的峰在某病患镇尿液有4人出现,对照组中未发现。首先排除样品间、仪器进样污染的可能,重新处理样品。
    2.重复实验:病例样本未变,增加了8个非某病患者的尿样,进样时病例与对照交叉进样,发现重现性很好,8个病例中仍有4位有614.7的峰。所有对照均没有此峰。由此断定,614.7与某病的相关性很大。通过分析,我找到与614.7峰伴随出现的峰。但还没有对614系列峰强度与病程的关系展开分析。也怀疑是由人为原因引起的误差,如用药、取样带入、饮食引起。考虑需要在收样时要注意这些问题。
    3.扩大样本量:扩大样本量(26个病例,20个对照)发现病例组中有2/3有614.7的峰,而20个对照都没有此峰。基本确定排除样本污染、偶然性的问题,确定614.7的峰的确是与某病有关。不能确定614.7与用药有关,也不能说明与血尿有关。由此,我考虑614.7是我很有可能是某病的某种标志物。但目前我主要是对某病的其中一种分型进行的分析,是否要对其他的病例类型进行分析。初步分析可能是一种大分子的碎片形成了614.7峰。则扩大扫描范围,欲将分子量扩大到10000。考虑治疗对其是否会产生影响。
    4.扩大分子量扫描范围:发现1228.4等系列峰,但没有很高的其他峰。推测1228.4可能是614.7的二聚体或多电荷产物。
    5.治疗后样本:收到6位治疗后的样本,之前6位都存在614.7的峰,但治疗后的尿液显示:均没有此峰。考虑可能原因是治疗所用的切除术,使得故治疗后未出现此峰。由此,将对614.7可能作为某种生物标志物,下一步工作是对其进行鉴定。
    6.未知物的分离纯化
    a)选择TOF中614.7含量很高的样本,以此进行纯化。
    b)选择适当的色谱柱:10*250mm,5μm的C18柱。
    c)液相分离条件的摸索:起初用纯甲醇和水作为流动相,发现峰拖尾较严重,即加入三氟乙酸,改善了峰形。在12min左右,出现较大的峰,强度很大。
    d)分离纯化 :在12min时根据峰形接收流出液。
    e)冷冻干燥
    i.发现试管中有多少不一的白色粉末,起初考虑是流动相中的三氟乙酸所致,但通过同时用三氟乙酸的流动相冷冻干燥后发现没有一点粉末,得出所要的粉末是目标物质,而非三氟乙酸。猜测三氟乙酸在冷冻干燥中蒸发掉了。
    ii.二次纯化:发现一个很宽的峰,没有其他峰。间接说明第一次纯化的样品纯度较高。
    7.未知物的鉴定
    a)氨基酸含量的测定:氨基酸分析仪;样品送至某理化测试中心,结果为几乎不含氨基酸。
    b)氨基酸的茚酸酮反应(自己做):40mg/10ml(茚酸酮/水),取适量冻干粉末。显色反应后发现颜色未改变,反应为阴性。
    c)NMR波谱分析(我没有NMR)
    i.某大学氢谱
    ii.某大学氢谱、碳谱(这个谱图我不是特别理解,还在学习中)
    d)质谱峰的分析:
    如图,通过对1.52min的峰进行分离纯化,对614.7、360.9、95.6等峰进行MS/MS扫描,获取其碎片信息,并推测其结构组成。通过分析,发现可能含有碘。

    1.52min流出峰的质谱图
    e)网上数据库检索:发现医院用作某病检查的某种造影剂含有碘,且分子量是613.7,结合质谱分析的结果,由此推测所检测的物质是这种造影剂在体内的代谢产物。

    8.解释
    a)治疗前后:治疗前做某检查,治疗后不做。故治疗后的样本中未出现614.7的峰。
    b)部分患者没有此峰:采样的时间,有的在没有确诊前(可能未做某检查)收样,或在某检查后一段时间收样(造影剂已代谢排出)。
    9.继续分析
    a)排除614.7及其系列峰的干扰,继续分析。
    b)将Markerlynx所分析的数据导入Simca-P分析软件。分析发现某病患者的样本能够和对照样本很好的区分开来。尚可能存在有鉴别意义的点,需要进一步分析。
    这篇文章通过代谢组学研究平台发现了潜在的有意义的物质,最后经多方面的手段进行了定性。通过这次试验发现代谢组学研究的初步阶段,对样品的全面深入了解是非常重要的,要考虑到可能会出现杂质干扰,这个对后期的数据处理非常重要,否则会走不少弯路!其他的目标物质仍在研究中!欢迎提出宝贵的意见!


    浅谈代谢组学研究平台的建立
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  • titi

    第1楼2009/09/15

    代谢组学近年来很热的研究啊~希望楼主能够针对代谢组学的实验室进行下介绍,可以对贵实验室的布局形式、仪器配置(及检测用途)进行介绍,可以作为实验室建设版区的原创作品参赛啊!!

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  • dickwang2008

    第2楼2009/09/15

    TiTi来我们版面拉人啦,支持支持

    carollee 发表:代谢组学近年来很热的研究啊~希望楼主能够针对代谢组学的实验室进行下介绍,可以对贵实验室的布局形式、仪器配置(及检测用途)进行介绍,可以作为实验室建设版区的原创作品参赛啊!!

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  • dickwang2008

    第3楼2009/09/15

    小猪果然是人才,这篇写的太好啦!目前代谢组学在国内正处于发展阶段,出成果就靠你们啦

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  • 小猪飞飞

    第4楼2009/09/16

    其实我写的比较泛,还有好多内容没有深入展开。如上所说,毕竟是抛的一块砖嘛,好多版友的玉还都藏着呢!有兴趣的版友可以展开写写,分享下心得!

    还要多提提建议,要不然网络原创大赛可真就是个人的工作了。在活动的初衷的基础之上,如果大家耐心地看完之后,都能够来谈谈,新手们不要怕说错话,高手们不要吝啬自己的想法,这样才能共同进步。这么好的一个交流平台不充分利用的话,可惜了!

    就拿代谢组学研究平台来说,我想除了少数几家单位能够有完整的研究团队之外,多数还是孤军奋战吧!因此多交流交流很有必要!

    来这边的应该是年轻人居多,想法也会比较多。多来转转、留下你们的足迹,共同进步!

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  • titi

    第5楼2009/09/16

    讲得很好~~这也是我们的初衷啊~

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  • hujiangtao

    第6楼2009/09/16

    应助达人

    现在基因代谢很热呀 楼主讲的很好的实例

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  • hychen2003

    第7楼2009/09/17

    楼主这个实例讲得很细致,包括图谱、数据处理等方面。想请教一下,你们在尿液处理时,只是离心过膜会不会造成柱残留,我们之前的实验就是尿液加乙腈:水(1:1)稀释一倍,然后15000高速离心进样,结果进样十几针后造成柱子污染,样品在柱上不保留,柱压升高,每组间的空白也差别。注:我们用的是Aquity BEH C18的柱子。

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  • 小猪飞飞

    第8楼2009/09/17

    我也是用的Aquity BEH C18,用过一段时间之后柱压确实会上升,大概在7000~8000psi,因此还可以接受。仪器的重现性确实很好,我重新分析近两个礼拜的样品,响应几乎没有变化。这个比我用的四级杆好多了(也是waters的)。

    当然,下一步会根据实验进行必要的前处理,包括你所提到的稀释,等等。

    此外,每次做完实验,尤其是像这种样品前处理较简单的,最好要长时间冲洗柱子,必要的时候加上0.1%的醋酸、柱温高些,防止蛋白堵柱子。

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  • hallang12

    第9楼2009/09/29

    代谢组学是现在研究的一个热点,尤其是在中医药方面和疾病相关标志物寻找方面具有非常大的优势,但是我感觉代谢组学是一个很庞大的,需要很多仪器和多方面技术相结合的一个大的综合,不是一个人或者、一个科研团队可以完成的,需要各个方面的人,互相努力才能完成一个庞大的工程,就象基因组那样。

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  • 小猪飞飞

    第10楼2009/09/29

    的确,代谢组学是一门综合性的学科,需要多学科的人才共同完成!

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